【正文】 可繪制出洗脫曲線（以管號(hào)或洗脫體積為橫坐標(biāo)，以每管溶液中樣品的濃度或活性為縱坐標(biāo)）。總之，我們必須經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)與調(diào)整，才能得到最佳的洗脫條件。在選擇了洗脫方式后，同時(shí)還應(yīng)注意洗脫時(shí)的速率。 梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)，可以采用逐漸改變?nèi)軇┑男再|(zhì)，形成一個(gè)濃度、極性、離子強(qiáng)度或 pH值等連續(xù)遞增或遞減的梯度，從而使各組分依次被洗脫，這種方法稱為梯度洗脫。 簡(jiǎn)單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑進(jìn)行洗脫 ，也就是溶劑的種類 、 濃度 、 pH等都不變化 。 應(yīng)注意的是： ①樣品溶液不能有沉淀出現(xiàn)，否則應(yīng)過(guò)濾后再上樣。 通常加樣量應(yīng)少于 20%的操作容量 ， 加樣體積應(yīng)低于5%的床體積 。平衡液體積一般為 2~3倍柱床體積，以保證平衡后柱子符合填充均勻、松緊一致和沒(méi)有氣泡的標(biāo)準(zhǔn)。用溶劑徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點(diǎn)。 在填充層析柱之前，對(duì)所要填充的材料需作一些預(yù)處理。 層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在1:25－ 1:100之間 。如果在 A瓶和 B瓶中注入的是不同的pH或極性的溶液，同樣也可以得到類似于上述的三種梯度類型。 檢測(cè)儀是用來(lái)監(jiān)測(cè)通過(guò)層析柱的流出液的儀器 ， 主要有紫外檢測(cè)器 、 熒光檢測(cè)器 、 示差折光率檢測(cè)器和電導(dǎo)檢測(cè)器等 。 溶劑池主要用于儲(chǔ)存樣品和作為流動(dòng)相溶液或溶劑的儲(chǔ)存器 。 親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力 （ 如酶和抑制劑 、 抗體和抗原 、 激素和受體等 ） ， 將某種配體連接在載體上作為固定相 ， 而對(duì)能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù) 。 吸附層析是以吸附劑為固定相 ， 根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù) 。 氣相層析是指流動(dòng)相為氣體的層析 ， 而液相層析指流動(dòng)相為液體的層析 。 柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形 ， 在柱中進(jìn)行層析 。 13. 保留時(shí)間 （ tR） 及保留體積 （ VR） 自流動(dòng)性中的某一組分進(jìn)入層析柱開(kāi)始到出現(xiàn)該組分峰最高點(diǎn)時(shí) ， 所需要的時(shí)間稱為保留時(shí)間 （ tR） ， 所收集的體積稱為保留體積 （ VR） 。 因?yàn)樗姆肿恿看螅?為 200萬(wàn) ） ， 在各種型號(hào)的凝膠中都被完全排阻 ， 并且它呈藍(lán)色 ， 易于觀察和檢測(cè) 。 8. 洗脫體積 （ Ve） 洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積 。 7. 床體積 （ Vt） 通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積 （ Vt） 。 6. 操作容量 （ 或交換容量 ） 在一定條件下 ， 某種組分與基質(zhì) （ 固定相 ） 反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí) ， 存在于基質(zhì)上的飽和容量 ， 我們稱為操作容量 （ 或交換容量 ） 。 5. 正相色譜與反相色譜 正相色譜是指固定相的極性高于流動(dòng)相的極性 ，因此 ， 在這種層析過(guò)程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度快 ， 先從柱中流出來(lái) 。 總之 ， 影響分離度或者說(shuō)分離效率的因素是多方面的 。圖是計(jì)算分辨率的示意圖。 分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件 。 相對(duì)遷移率是指：在一定條件下 ， 在相同時(shí)間內(nèi) ， 某一組分在固定相中移動(dòng)的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動(dòng)的距離之比值 。 分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的重要依據(jù) 。 它可以是固體物質(zhì) （ 如吸附劑 ， 凝膠 ， 離子交換劑等 ） ， 也可以是液體物質(zhì) （ 如固定在纖維素或硅膠上的溶液 ） ， 這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附 ， 溶解 ， 交換等作用 。由此可見(jiàn)，傳質(zhì)阻力與流動(dòng)相中組分的擴(kuò)散和固定相中組分的擴(kuò)散有關(guān)。分子擴(kuò)散對(duì)于氣相色譜和液相色譜的影響大相徑庭，由于組分在液體中比氣體中的擴(kuò)散要小 105倍，它對(duì)液相色譜的影響可以忽略。它與流動(dòng)相的性質(zhì)、流速及組分的性質(zhì)無(wú)關(guān)。由上式可以看出，當(dāng)流動(dòng)相流速一定時(shí)， A、 B、 C越小， H也越小，理論塔板數(shù)越大，柱效就越高。 實(shí)際上 ， 層析分離與分子的擴(kuò)散及運(yùn)動(dòng)速度是有關(guān)的 ， 而且 ， 同一溶質(zhì)在不同流動(dòng)相流速下將具有不同的理論塔板數(shù) ， 所以 ， 后來(lái)又發(fā)展了非平衡態(tài)的層析理論 ， 或稱速率理論 。 則理論塔板數(shù)量 n為： L/H （ 2） 速率理論 根據(jù)上述假設(shè) ， 塔板理論初步闡明了組分在層析中的遷移速度 。 3. 溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù) 。 對(duì)于一個(gè)層析柱來(lái)說(shuō) ， 可作如下基本假設(shè)： 1. 層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的 ， 而且層析柱由若干層組成 。根據(jù)塔板理論，可以把層析柱設(shè)想由若干個(gè)層（即塔板）組成，被分離組分在每一個(gè)層（塔板）里的兩相之間達(dá)到一次平衡，就進(jìn)行了一次分配，相當(dāng)于經(jīng)過(guò)一個(gè)層（塔板）高。現(xiàn)在它們已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的分析分離手段。此后 1941年Martin用具有親水能力的硅膠介質(zhì)填充的層析柱分離氨基酸成功，并提出了液 液分配層析最初的塔板論。 他向填充有 CaCO3粉末的柱內(nèi)加入植物色素提取液 ， 并以石油醚淋洗 ， 由于 CaCO3對(duì)葉綠素中各種色素的吸附能力不同 ， 色素被逐漸分開(kāi) ，柱上端呈黃色 ， 較下端呈綠色 ， 出現(xiàn)了不同顏色的譜帶 。 1903年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（ M. Tswett） 首先使用此法分離植物色素 。 但是，當(dāng)時(shí)這種方法并沒(méi)引起人們太多的關(guān)注，直到 1931年 R. Kuhn用此法從蛋黃中分離出黃體素、從玉米中分離出玉米黃色素開(kāi)始，層析技術(shù)才逐漸引起了人們的重視。 80年代后期，人們?cè)跉庀鄬游黾夹g(shù)和液相層析技術(shù)的基礎(chǔ)上還發(fā)展了超臨界色譜。 （ 1） 塔板理論 層析分離技術(shù)的目的是要將混合樣品中各組分彼此分開(kāi)，它遵循相似相溶的原理，在互不相溶的兩相（固定相和流動(dòng)相）之間進(jìn)行分配。這樣分配系數(shù)小的組分和分配系數(shù)大的組分就能彼此分開(kāi)，分配系數(shù)小的組分每次達(dá)到平衡的時(shí)間短，從層析柱中先流出；分配系數(shù)大的組分每次達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)，從層析柱中后流出。 2. 每個(gè)塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動(dòng)相之間瞬間達(dá)到平衡 ， 且忽略分子縱向擴(kuò)散 。 根據(jù)以上假定 ， 將連續(xù)的層析過(guò)程分解成了間歇的動(dòng)作 ， 這與多次萃取過(guò)程相似 ， 一個(gè)理論塔板相當(dāng)于一個(gè)兩相平衡的小單元 （ 一次萃取 ） 。 但是塔板理論采用的是平衡過(guò)程的研究方法 ， 忽略了許多動(dòng)力學(xué)因素對(duì)柱分離效率的影響 。 H=A+B/u+Cu 其中， A、 B、 C分別表示渦旋流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力的 3種系數(shù)； u表示流動(dòng)相線性流速。由此可見(jiàn)，渦旋流現(xiàn)象的發(fā)生是由于固定相的顆粒大小不均勻及填充柱的不均勻引起各組分在層析柱中所發(fā)生的位移不同。當(dāng)樣品隨著流動(dòng)相流經(jīng)層析柱的時(shí)候，樣品的前端和后端的濃度一定會(huì)降低，這就產(chǎn)生了濃度差，有了濃度差就會(huì)形成自由擴(kuò)散，即分子擴(kuò)散。那么，流動(dòng)相把組分交給固定相速度，固定相把組分交給流動(dòng)相的速度，以及各組分在固定相和流動(dòng)相中達(dá)到平衡的速度都是影響層析的因素，這就是傳質(zhì)阻力。 層析的基本概念 1. 固定相： 固定相是由層析基質(zhì)組成的 。 3. 分配系數(shù)及遷移率 （ 或比移值 ） ： 分配系數(shù)是指：在一定的條件下 ， 某一組分在固定相和流動(dòng)相中含量 （ 濃度 ） 的比值 ， 常用 K來(lái)表示 。 實(shí)驗(yàn)中我們還常用相對(duì)遷移率的概念 。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的 。用 Rs來(lái)表示。一般而言，Rs ，Rs=。 否則 ， 我們將不能得到預(yù)期的效果 。 一般來(lái)說(shuō) ，反相色譜 （ 或反相柱 ） 用于分離純化極性小的有機(jī)分子 （ 有機(jī)酸 、 醇 、 酚等 ） 。 因此 ， 實(shí)際操作時(shí) ， 要想能得到有效的分離 ， 樣品的加入量要盡量少些 。 柱床體積 Vt可以通過(guò)加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處 ， 然后測(cè)量水的體積來(lái)測(cè)定 。 一般常用藍(lán)色葡聚糖 2022作為測(cè)定外水體積的物質(zhì) 。 12. 死時(shí)間 （ t0） 及死體積 （ V0） 流動(dòng)相中的溶質(zhì)進(jìn)入層析柱后 ， 不被固定相所吸附 ， 與固定相不發(fā)生任何作用 ， 通過(guò)柱所需要的時(shí)間 ， 稱為死時(shí)間 （ t0） ；通過(guò)柱所收集的體積 ， 稱為死體積 （ V0） 。 薄層層析是將基質(zhì)在