【正文】 易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。對細(xì)菌、霉菌和病毒有一定的滅活作用，用于滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，常用終濃度為 %－ %。 、 滅活劑 ? （ 3） ?－丙烯內(nèi)脂（ BPL） 本品為無色有刺激氣味的液體，對皮膚、粘膜有強(qiáng)刺激性，并具有致癌性。用于滅活細(xì)菌的濃度為%— %，用于滅活病毒時濃度為 %— %。此法兼有懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法的優(yōu)點，容易大量培養(yǎng)細(xì)胞，特別是適合那些不能被懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞和原代細(xì)胞。國際上普遍使用無毒塑料轉(zhuǎn)瓶，直徑為 15～ 20cm，長度為 30～ 80cm，多為一次性使用。 大量培養(yǎng)細(xì)菌的方法 ? （ 2） 液體靜置培養(yǎng)法 此法適于一般菌苗的生產(chǎn)，培養(yǎng)容器可用大玻瓶也可用培養(yǎng)罐 (或稱發(fā)酵罐 )，按容器的深度，裝入適量培養(yǎng)基，一般是容器深度的 1／ 2～ 2／ 3為宜，經(jīng)高壓蒸汽滅菌之后，冷至室溫接入細(xì)菌種子，保持適宜溫度靜置培養(yǎng)。小鼠腹腔接種時，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其頭背部，翻轉(zhuǎn)鼠體使腹部向上，把鼠尾和右后腳夾于小指和無名指之間，右手將針頭平行刺入腿根處腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射 。 動物接種途徑和接種方法 ? 4）靜脈接種 小鼠尾靜脈注射時，先將小鼠尾巴在 50－55?C水中浸泡 1分鐘，使尾靜脈擴(kuò)張，用鼠缸扣住鼠體，露出尾部，用左手拇指和中指將鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端處平行刺入針頭，再向下刺入靜脈，慢慢注入 。在背部、頸部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮膚，用針頭斜面向外，與皮膚面平行刺入 2－ 3mm，接種 。 幾種病毒接種途徑及收獲材料 病毒 胚齡 接種 途徑 培養(yǎng) 溫度 培養(yǎng) 時間 雞胚 變化 收獲 材料 雞新城疫 9－ 11 尿囊腔 37℃ 左右 3－ 5天 出血、死亡、血凝 尿囊液 雞痘 10－ 11 CAM 37℃ 左右 5天 膜上痘皰 CAM 雞傳染性 喉氣管炎 10－ 11 CAM 37℃ 左右 5天 膜上痘皰 CAM 狂犬 6－ 7 卵黃囊 37℃ 左右 8－ 10天 卵黃囊 乙腦 6－ 8 卵黃囊 37℃ 左右 3天 死亡 雞胚 動物接種技術(shù) 動物接種途徑和接種方法 ? 1）腦內(nèi)接種 給小鼠和地鼠腦內(nèi)接種時，用左手大拇指和食指固定頭部，消毒左側(cè)眼與耳之間上部注射部位，并于眼后角、耳前緣及顱前后中線所構(gòu)成之位置中間刺入針頭 2－ 3mm，乳鼠接種 ，成年鼠和地鼠為 。每日照蛋 1－ 2次，棄去接種后 24小時內(nèi)非特異死亡的雞胚， 24小時后死亡的雞胚隨時撿出，置 4－ 8?C冷卻 4－ 24小時?；蛟谌斯馐铱滋幊?30?角刺入針頭約，接種 － ，用石蠟封孔。也可用人工氣室法進(jìn)行，在胚胎附近處和氣室處各打一小孔，然后用吸球緊貼氣室小孔處輕輕吸氣，造成負(fù)壓，形成人工氣室，接種 － ，用石蠟封孔。 ? 雞胚接種途徑和接種方法 ? 1）尿囊腔途徑 取 9－ 11日齡的雞胚，在燈光照射下，在離氣室約 － ，作為接種部位，在氣室和待接種部位各打一小孔，將受精卵橫放在蛋盤上，在待接種處垂直刺入針頭約 ，接種 － ，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。 ? 4）微載體培養(yǎng) 通過攪拌使微載體懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞通過貼附在微載體固體顆粒表面上生長形成細(xì)胞單層，細(xì)胞的濃度較大、生長快。 細(xì)胞培養(yǎng)方法 ? 1）靜止培養(yǎng) 靜止培養(yǎng)是指將制備好的細(xì)胞懸液分裝在適宜的培養(yǎng)瓶中，密閉瓶口，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，形成細(xì)胞單層后，接種病毒懸液， 37－ 38?C左右繼續(xù)培養(yǎng)。 各種傳代水平細(xì)胞系檢查 檢驗項目 主細(xì)胞庫 工作 細(xì)胞庫 最高限制 代次細(xì)胞 高于最高代次10代的細(xì)胞 顯微鏡檢查 ＋ ＋ ＋ － 細(xì)菌和霉菌 ＋ ＋ ＋ － 支原體 ＋ ＋ ＋ － 病毒 ＋ ＋ ＋ － 細(xì)胞鑒別 ＋ － ＋ ＋ 胞核學(xué)檢查 ＋ － ＋ ＋ 致瘤和致癌性 ＋ － ＋ ＋ 傳代細(xì)胞的保存 ? 1) 細(xì)胞保存 收集新鮮細(xì)胞，用細(xì)胞冷凍保護(hù)液 (含 20％犢牛血清、 5％～ 10％二甲基亞砜的營養(yǎng)液 )調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá) 100萬一 200萬個細(xì)胞／ m1，分裝于安瓿中，封口， 4℃ 預(yù)冷 30min，封口嚴(yán)密的安瓿移至 50～－ 70?C冰箱中預(yù)冷，然后移至液氮罐內(nèi)貯存，可保存數(shù)年。 ? 3）傳代細(xì)胞系 由腫瘤組織培養(yǎng)而成或由細(xì)胞株轉(zhuǎn)化而來。但原代細(xì)胞不能在體外多次傳代，組織原材料的來源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其質(zhì)量，影響產(chǎn)品的純凈和安全性。血清起營養(yǎng)作用，保護(hù)細(xì)胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促進(jìn)細(xì)胞在玻璃上附著和鋪開。 病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 ? 4) 維生素 大部分維生素與細(xì)胞代謝有關(guān)。 ? 2) 碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。 、病毒培養(yǎng)基本技術(shù) ? 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，由于病毒缺乏自主復(fù)制的酶系統(tǒng)，不能獨自進(jìn)行物質(zhì)代謝，必須依賴宿主細(xì)胞或細(xì)胞的某些成分合成核酸和蛋白質(zhì)，所以只能在易感的細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制的方式進(jìn)行增殖，而不能在任何無細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)生長。常用的有厭氧罐法。 、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) ? 厭氧菌的培養(yǎng) ? 生物學(xué)方法 在培養(yǎng)基中加入植物或動物組織（如馬鈴薯、發(fā)芽谷物、滅菌的新鮮動物組織塊），以消耗養(yǎng)氣或使氧化還原電勢下降。 、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) 需氧菌的培養(yǎng) ? 平板培養(yǎng)法 有平板劃線培養(yǎng)法和傾注培養(yǎng)法。有產(chǎn)品批準(zhǔn)文號者，可由生產(chǎn)企業(yè)直接向菌種中心或分中心領(lǐng)取。 ? 原種和由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心或分中心負(fù)責(zé)保管；基礎(chǔ)種子由菌種中心或分中心負(fù)責(zé)制備、鑒定、保管和供應(yīng)；生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)自行制備、鑒定和保管。 ? 結(jié)凍保存 有些病毒可用含毒組織在低溫條件下（ 20?C以下）。病毒生產(chǎn)種子應(yīng)作含量測定和純凈檢查。病毒原種應(yīng)規(guī)定其生物學(xué)特性、理化特性、血清學(xué)特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并純粹。 ? 轉(zhuǎn)移因子：用動物臟器或組織提取制成，作為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高生產(chǎn)性能。 （三）治療及其他制品 ? 抗血清：用抗原多次免疫動物，提取血清制成，用于治療或預(yù)防動物疾病。 ? PCR（ RT－ PCR）擴(kuò)增技術(shù)。 ? （ 7）膠體金免疫檢測技術(shù)。 ? （ 3）中和試驗：將特異性血清與相應(yīng)病原混合，用血清 — 病毒混合物接種靶動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察感染情況進(jìn)行疾病診斷。制造簡便、成本低、安全、免疫期長、熱穩(wěn)定性好，但仍未商品化生產(chǎn)。疫苗毒力不易恢復(fù)，穩(wěn)定性好，可配合鑒別診斷方法，區(qū)別免疫動物和自然感染動物。 2）病原 → 基因工程技術(shù) → 保護(hù)性抗原基因序列插入合適的表達(dá)質(zhì)粒 → 高效穩(wěn)定表達(dá) → 生產(chǎn)抗原 → 亞單位疫苗。 4）基因工程改造弱毒株。 但用量較大、接種次數(shù)多、免疫力產(chǎn)生慢、注射困難、注射局部可能有反應(yīng)等。 預(yù)防用獸用生物制品包括：滅活疫苗、活疫苗、重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重組活載體疫苗和核酸（ DNA）疫苗。獸用疫苗生產(chǎn) 一、獸用生物制品分類 二、獸用疫苗的制備技術(shù) 三、獸用診斷試劑的制備技術(shù) 四、獸用生物制品檢測技術(shù) 一、獸用生物制品分類 獸用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（細(xì)菌、病毒、衣原體、鉤端螺旋體等）及其代謝產(chǎn)物、寄生蟲、動物血液或組織等為原材料，采用生物學(xué)、分子生物學(xué)或生物化學(xué)等相應(yīng)技術(shù)制成的生物制劑，用于預(yù)防、治療或診斷畜禽疫病。 （一）預(yù)防用獸用生物制品 將細(xì)菌、病毒、寄生蟲等接種于特殊基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，收獲其抗原單位或亞單位，或用人工合成的抗原單位或亞單位制備而成的活的或滅活的、具有特異性和免疫原性的生物制品，用于預(yù)防靶動物的疾病。 滅活疫苗穩(wěn)定、安全，便于運輸和保存，易于提純純化和制備多價、多聯(lián)苗。 3）異種毒（菌、蟲）株。 重組亞單位疫苗 1）微生物 → 物理和化學(xué)方法→ 提取有效抗原成分。 基因缺失疫苗 病原體 → 基因工程方法 → 缺失致病性基因或非必要糖蛋白 → 保持免疫原性 → 降低致病性。 核酸疫苗（基因或 DNA疫苗） 病原保護(hù)性抗原基因 → 連接細(xì)菌或病毒 DNA → 直接導(dǎo)入動物體 →表達(dá)抗原 → 誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)。 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) ? （ 2） 免疫沉淀試驗抗原：包括試管沉淀法、單相免疫擴(kuò)散試驗和雙相免疫擴(kuò)散試驗、免疫電泳、對流免疫電泳等。 ? （ 6）熒光抗體染色技術(shù)：直接法、間接法、競爭法等。 ? （ 2）分子生物學(xué)技術(shù)。 ? 核酸探針。 ? 干擾素：用病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。 、 菌（毒）種 標(biāo)準(zhǔn) ? 原種 細(xì)菌原種應(yīng)規(guī)定其培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、毒力和免疫原性等，并作純粹檢查。細(xì)菌等生產(chǎn)種子應(yīng)作純粹檢查。 、菌（毒）種保存 ? 冷凍真空干燥法 凍干的菌種一般在 2— 8?C保存；凍干的毒種一般在 20?C以下保存， 溫度越低保存期越長。 、菌（毒）種的管理 ? 生產(chǎn)檢驗用菌（毒）種實行分級管理制度，種子分三級（原種、基礎(chǔ)種子和生產(chǎn)種子）。一、二類菌種時，必須由?。ㄊ?、自治區(qū)）獸醫(yī)行政主管部門審核，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)后，方可供應(yīng)。 、病原培養(yǎng) ? 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) ? 細(xì)菌的繁殖是以二分裂法進(jìn)行，分四個時期：遲緩期（細(xì)菌處于靜止適應(yīng)狀態(tài)）；對數(shù)增殖期（以恒定的速度增殖）；穩(wěn)定期（細(xì)菌增加數(shù)與死亡數(shù)保存平衡）；衰退期（活菌數(shù)下降）。 ? 接種試驗動物進(jìn)行培養(yǎng)。 ? 物理學(xué)方法 利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的養(yǎng)氣，形成無氧狀態(tài)，以利于厭氧菌的生長。此時容器內(nèi)含有較高濃度的二氧化碳，將容器放入適宜溫度培養(yǎng)。常用弱碳酸氫鹽來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的 pH值，培養(yǎng)液的 pH值一般維持在 。維持細(xì)胞生長的最低營養(yǎng)要求需要以下 13種氨基酸。 ? 5) 蛋白質(zhì) 動物血清是蛋白質(zhì)的主要來源，常用的有胎牛血清或犢牛血清。病毒對原代細(xì)胞易感，繁殖滴度高，且無致瘤性等。不能在體外無限制傳代，從幾代至幾十代，兼有原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的優(yōu)點，病毒對其易感，質(zhì)量可控，適用于繁殖病毒。但存在潛在的致瘤性，要求背