現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生-全文預(yù)覽
【正文】 MO1， SUMO2， SUMO3。 泛素 C末端水解酶（ UCHs） UCHs多為含巰基蛋白酶，分子量大小不等，能特異識(shí)別泛素 C末端區(qū)域，解離泛素與靶蛋白的結(jié)合 , 促進(jìn)泛素再循環(huán)，所以對(duì)泛素系統(tǒng)的正常運(yùn)行很必要。 甘氨酸殘基 C末端殘基 Positive charged 酶 系 統(tǒng) ? 泛素 激活酶 （ UbiquitinActivating Enzyme, E1） ：在人類僅發(fā)現(xiàn)一種 ，主要功能是激活泛素 。目前發(fā)現(xiàn)所有生物的泛素都是由氨基酸編碼的，而且序列相當(dāng)保守。蛋白質(zhì)通過(guò)動(dòng)態(tài)相互作 用，形成大的復(fù)合體，在特定的時(shí)間和空間中完成特定的功能，這其中也發(fā) 生特定的蛋白質(zhì)修飾。 4，樣品是“ 死”的 . 掃描電子顯微鏡 優(yōu)點(diǎn)： 1，樣品制作較簡(jiǎn)便 2，樣品可動(dòng)自由度大 3，圖像富有立體感 4，放大范圍廣 5，可從觀察樣品表現(xiàn)形貌獲得 多方面資料 6，可進(jìn)行微區(qū)成分分析。 3，自動(dòng)化程度高 。 ? AFM對(duì)于生物系統(tǒng)的成像分析比光學(xué)顯微鏡具有更高的分辨率 （ 大約可以到 1nm） ， 比電鏡觀察所需要的樣品處理更接近于生理?xiàng)l件 ， 并且比光譜學(xué)技術(shù) （ 通常需要從大量光譜信號(hào)中間接推導(dǎo)出結(jié)構(gòu)信息 ） 更直觀 。 熒光滴定方法分析小分子化合物 與蛋白的結(jié)合 關(guān)鍵點(diǎn)： 熒光分光光度計(jì) 純化蛋白（能夠自發(fā)熒光，脯氨酸、色氨酸基團(tuán)） 蛋白質(zhì)相互作用儀 Cell, virus, bacteria, protein, DNA and small molecular。 ? 二維 核磁共振 技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)分子在溶液中的結(jié)構(gòu)。 熒光探針 JC1檢測(cè)線粒體膜電位 蛋白結(jié)構(gòu)的分析 ? 利用 Edman降解法直接測(cè)定蛋白質(zhì)分子中的肽段序列，并拼接出蛋白質(zhì)分子的全序列。 蛋白表達(dá)量以面積表示。 ? 最大優(yōu)點(diǎn)：樣品無(wú)需染色，可以觀 察活細(xì)胞 流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用 細(xì)胞分選 周期、凋亡測(cè)定 細(xì)胞表面蛋白定量 DNA滲入量測(cè)定 線粒體膜電位測(cè)定 流式細(xì)胞術(shù)定量分析 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 DAPI染色細(xì)胞 流式細(xì)胞儀分析 可用于分選細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)直接定量分析 細(xì)胞存活率 ? PI（碘化丙啶）染色細(xì)胞，不能透過(guò)活細(xì)胞膜，但可以結(jié)合到死細(xì)胞的 DNA碎片上。 細(xì)胞異體融合 ? 通過(guò)誘導(dǎo)融合劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合 。 ? FRAP用于測(cè)量 2維或 3維分子運(yùn)動(dòng)的力度。 熒光顯微鏡中只有激發(fā)熒光可以成象 ， 因?yàn)楫a(chǎn)生激發(fā)光的光全被樣品與照相機(jī)之間的濾光片吸收 。 ? ChIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍： CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的 ChIPonchip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量 篩選； ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找 反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)； RNAChIP用于研 究 RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。 凝膠阻抑實(shí)驗(yàn) （ Gel retardation assay） ? 當(dāng) DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的 DNA片段或寡核苷酸結(jié)合而形成 DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使 DNA片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA片段的泳動(dòng)速率慢得多，在X光膠片上形成一較游離 DNA片段滯后的帶型。 這種方法可以分析溶液中 、 細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白 ， 但只能是定性或半定量的實(shí)驗(yàn) 。 ? 關(guān)鍵點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)， realtime PCR儀 倍數(shù)差 原位雜交定位基因的表達(dá) 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2， DNA 探針的制備（地高辛或同位素標(biāo)記） 3，探針標(biāo)記 mRNA顯示 mRNA 4，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的 DNA 探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機(jī)；對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 KAI1 RNA干擾技術(shù) ? 發(fā)現(xiàn)者獲得諾貝爾獎(jiǎng)； ? RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是一種可以在細(xì)胞內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。 ? RTPCR的用途很廣泛，既可以用來(lái)構(gòu)建 cDNA文庫(kù)，也可以獲得感興趣的基因的 cDNA序列。它與普通 PCR的區(qū)別就在于它是以 mRNA為最初始的模板。通過(guò)熒光吸收裝臵檢測(cè)發(fā)出熒光的多少來(lái)反映模板量的高低，從而達(dá)到實(shí)時(shí)定量的目的。 關(guān)鍵點(diǎn)：確定 19－ 21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選 寡核苷酸） ，cDNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA的試劑盒（效果好但價(jià)格貴），或表達(dá)載體 pSuper, 轉(zhuǎn)染試劑盒；要設(shè)臵好對(duì)照（不相關(guān)的序列） 不足：干擾不夠穩(wěn)定、不完全，不能長(zhǎng)時(shí)間作用 ? 熒光酶基因（ Luc）是從螢火蟲(chóng) cDNA文庫(kù)中克隆的 ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織沒(méi)有任何內(nèi)源性熒光素酶活力，所以 Luc可作為非常靈敏的遺傳報(bào)告基因 ? 熒光酶報(bào)告基因具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、費(fèi)用低、用途廣、可定量等優(yōu)點(diǎn) 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 關(guān)鍵點(diǎn)： Luciferase報(bào)告基因，表達(dá)載體， ?gal, 轉(zhuǎn)染效率，熒光檢測(cè)儀 基因芯片分析 ? 設(shè)臵好對(duì)照組，取樣（ mRNA） ? 由公司測(cè)定，提供基因檢測(cè)結(jié)果（根據(jù)細(xì)胞功能分類） ? 排除變化相同的基因 ? 確定變化差異的基因 ? 選擇感興趣的基因進(jìn)一步證實(shí)它們的變化 ? 該方法特別適合用于信號(hào)通路中新的下游靶基因的發(fā)現(xiàn) 蛋白研究的各種方法 Western blotting 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體； ECL顯示試劑；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 不同抗體差別很大：用量、效果、特異性 使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關(guān) （反比關(guān)系） 優(yōu)點(diǎn)：可用于定量分析 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 蛋白半衰期 CHX(cycloheximide) 放線菌酮 有的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短 CHX的作用是抑制新蛋白的合成 免疫組織化學(xué)方法顯示蛋白 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2，免疫組化染色 3，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體；切片機(jī)； 對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 蛋白的相互作用和 蛋白與 DNA的結(jié)合分析 免疫沉淀 /免疫印跡 (CoIP) Immunoprecipitation/Western blot ? 用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的某個(gè)目的蛋白質(zhì) （ 即免疫沉淀 ） ， 洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì) ， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） ， 最后用 Western blot 分析顯示另一個(gè)目的蛋白質(zhì) 。 ? 具有高天然性、高效率
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