浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定-全文預(yù)覽
【正文】 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 加樣順序：水 緩沖液 DNA酶，酶總是最后才加入到反應(yīng)體系中。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 限制性內(nèi)切酶由于能識(shí)別特異順序并進(jìn)行切割 ，因而在基因重組 、 序列分析 、 基因組甲基化分析及基因物理圖譜的繪制等技術(shù)中被廣泛應(yīng)用 。 ? 限制性內(nèi)切酶切割后的 DNA片斷 ， 有的產(chǎn)生粘性末端 ， 有的產(chǎn)生平末端 ?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近幾百種 (498種 )。 ? 根據(jù)它們的作用特點(diǎn) ， 可將其分為三類： Ⅰ 類和Ⅲ 類酶 ， 在同一種酶分子中兼有切割和修飾 （ 甲基化 ） 作用 ， Ⅰ 類酶由于切割位點(diǎn)隨機(jī) ， Ⅲ 類酶則由于切割位點(diǎn)不對(duì)稱 ， 因此這兩類酶的作用都不大 。 ?⑵ 、 電泳鑒定 ? 膠濃度： ~% ? 上樣量： 5ul質(zhì)粒 +1ul上樣緩沖液 ? 各步操作方法及注意事項(xiàng)解說(shuō)詳見(jiàn) P148。 見(jiàn) 圖 。 電泳時(shí)如用已知分子量的核酸作對(duì)照 ， 還可測(cè)定樣品核酸的分子量 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 電泳中所使用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠 ， 核酸中常用瓊脂糖凝膠 。 ? ② 開(kāi)環(huán)質(zhì)粒 DNA： （ ocDNA） 質(zhì)粒 DNA的兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 ， 從而形成松弛的環(huán)狀分子 。質(zhì)粒 DNA的提取與酶切鑒定 （一）質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ?質(zhì)粒簡(jiǎn)介 ? 質(zhì)粒是一種寄生性的自主復(fù)制子 ， 存在于細(xì)菌等細(xì)胞中 ， 為雙鏈閉環(huán)的 DNA分子 ， 大小為 1kb~200kb之間 ， 具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的能力 ， 但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要利用宿主細(xì)胞 （ 細(xì)菌 ） 編碼的一些酶和蛋白質(zhì) 。 ? 本試驗(yàn)采用微量堿變性法來(lái)分離純化質(zhì)粒 DNA，具體的分離純化原理如下： 0 細(xì)菌 （含質(zhì)粒） 溶菌酶 （震蕩） 破細(xì)胞壁 SDS NaOH （ 細(xì)菌 DNA和質(zhì)粒DNA均通過(guò)堿變性成為線狀分子 ） 破細(xì)胞膜 冰醋酸 細(xì)菌 DNA與變性蛋白和細(xì)胞碎片纏 繞在一起（不能復(fù)性） 質(zhì)粒 DNA經(jīng)復(fù)性后變?yōu)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀 離心 沉淀：細(xì)菌 DNA、細(xì)胞碎片等 上清：質(zhì)粒 DNA、 RNA、可溶性蛋白等 酚：氯仿 離心 下層：酚，氯仿 中層：變性蛋白 上清（水層）：質(zhì)粒 DNA、 RNA等 無(wú)水乙醇 離心 上清：可溶性雜質(zhì)等 沉淀：質(zhì)粒 DNA、 RNA等 RNase 質(zhì)粒 DNA （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 質(zhì)粒 DNA的天然結(jié)構(gòu)為共價(jià)閉環(huán) （ 超螺旋 ） 結(jié)構(gòu) ，但在制備過(guò)程中 ， 由于各種因素的影響 ， 同一質(zhì)粒 DNA的分子可能呈現(xiàn)出如下幾種構(gòu)型： ? ① 超螺旋型 （ 共價(jià)閉環(huán) ） 質(zhì)粒 DNA： （ cccDNA）超螺旋狀 。 ? DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定原理 ? 核酸是一種兩性電解質(zhì) （ 堿基 、 磷酸 ） ， 在 ， 核酸帶負(fù)電荷 ， 電泳時(shí)向正極移動(dòng) ，根據(jù)核酸分子所帶電荷的多少 ， 分
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