微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法-全文預(yù)覽
【正文】 隆文庫的統(tǒng)計(jì)分析 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) f p r i m e rr p r i m e rP C RCUTABCA B Cc o m m u n i tyDNA(A B C )i n te rn a l s i z e f ra g m e n tP A G E o n S E Q U E N C E R16S rDNA Fragment Size (base pairs) A B C Relative Intensity Liu et al., 1997, AEM 變性梯度凝膠電泳（ DGGE） ? 變性梯度凝膠電泳（ Denatured gradient gel electrophoresis， DGGE）最初是 Lerman 等人于 20 世紀(jì) 80 年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測 DNA 片段中的點(diǎn)突變。 16S ribosomal RNA ? Present in all life ? molecular chronometer – taxonomy (large database) – evolution ? one active bacterial cell: – ~ 104 copies – ~ 15 rRNA genes (., rDNA) (Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies) ? ~1500 nt (enough information) – four different domains – conserved regions (no variation among all life) – variable regions (V1V9) Source: Louis, B., Gene IV, 1997 環(huán)境 16S rDNA文庫的構(gòu)建與組成分析技術(shù) ? 1990年， Giovannoni等首先用這一方法分析馬尾藻海海面上浮游微生物的多樣性。 Diversity estimation based on molecular markers 實(shí)驗(yàn)原理 ? 16S rDNA是基因組的“ biomarker‖ ? – 核糖體 RNA是蛋白質(zhì)合成必需的， 16S rDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。AAgTAAgTgACTggggTgAgCg339。 ? 分析不同環(huán)境樣品中微生物混合 DNA的 ERICPCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個(gè)群落在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化。 ? 磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出 PLFA譜圖。 磷脂脂肪酸（ phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（ Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析 ? 脂肪酸具有屬的特異性，特殊的 甲基脂肪酸 已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。因此，醌的多樣性可定量表征微生物的多樣性，醌譜圖（即醌指紋）的變化可表征群落結(jié)構(gòu)的變化。 優(yōu)點(diǎn)： 不需要把微生物的細(xì)胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于培養(yǎng)而導(dǎo)致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。 ?干膜上都含有培養(yǎng)基和氧化還原染料四唑 ?微生物利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí)（產(chǎn)生的 NADH），會將四唑從無色還原成紫色 。 ?由 Garlan和 Mills于 1991年提出的群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)，通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。 ?Amann 等人報(bào)道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從 %（海水）到%（土壤）。 微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法： ? 在 70和 80年代：對微生物化學(xué)成分的分析，建立了一些微生物分類和定量的方法（生物標(biāo)記物方法），對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的認(rèn)識進(jìn)入到較客觀的層次上。 ?群落結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。 ?群落結(jié)構(gòu)決定了生態(tài)功能的特性和強(qiáng)弱。 ? 20世紀(jì) 70年代以前：傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，依靠形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較進(jìn)行分類鑒定和計(jì)數(shù)，認(rèn)識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。 ?采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少
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