【正文】 的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。每班分為兩小組簡(jiǎn)要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的布局及功能分區(qū)情況；針對(duì)每個(gè)分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時(shí)對(duì)所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實(shí)驗(yàn)通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。KNO395 g NH4NO3 g KH2PO g MgSO4?7H2O g CaCl2?2H2O g 注意事項(xiàng)：（1）配置母液前要仔細(xì)清洗存儲(chǔ)容器（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動(dòng)存儲(chǔ)瓶使其混合均勻；（3）溶解時(shí)最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因?yàn)樗袔Ь窟^大而產(chǎn)生沉淀，同時(shí)可以減緩綠藻的生成；（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時(shí)一定不要急；二是由于長(zhǎng)菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。7H2O g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細(xì)口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。其它溶液配制：BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺(tái)的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。植物學(xué)通報(bào),2005，22:3742。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)了解常用DNA提取方法的原理和技術(shù)，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測(cè)技術(shù)，為將來從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。DNA電泳是依據(jù)DNA帶負(fù)電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場(chǎng)的作用下DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)，分子量小的移動(dòng)快而分子量大的移動(dòng)慢，最終達(dá)到不同分子量大小的DNA分離的目的。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base， h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。l氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 181。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230； （3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至45 U/181。六、思考題簡(jiǎn)述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（一）試劑配制:LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后20℃保存。高壓滅菌15min，貯存于4℃。配制方法：5M KAc300ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。高壓滅菌15min，貯存于4℃。（二）實(shí)驗(yàn)步驟取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上23min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，20℃保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒電泳檢測(cè)一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。實(shí)驗(yàn)五 PCR技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康木酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。主要參考文獻(xiàn)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟PCR擴(kuò)增片段純化回收將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)連接溫度不宜太高，連接溫度過高（28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。六、思考題簡(jiǎn)述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻(xiàn)。重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul xgal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；2） ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；4） ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細(xì)胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。相對(duì)于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；注意分析電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。三、主要儀器及試材含有外源cDNA片段的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。主要參考文獻(xiàn)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，盡量減少臺(tái)面污染。吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g 15min。，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。16loading buffer（上樣緩沖液）:%溴酚藍(lán)，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15TBE:Trisbase 54g，EDTANa配制方法：1M TrisHCl（pH ）1ml， EDTA（pH ），加ddH2O至100ml。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時(shí)配制。溶液I: 50mM葡萄糖，25mM TrisHCl（pH ），10mM EDTA（pH ）。高壓滅菌15min，室溫貯存。三、主要儀器及試材含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機(jī)、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險(xiǎn)或有毒物質(zhì)，操作時(shí)要戴手套，并在專門區(qū)域操作。l TE充分溶解備用。：向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1TE，37℃水浴1530分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時(shí)，然后加入700 181。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 : CTAB提取液：(1)100 mM TrisHCl(PH )， M NaCl，50 mM EDTA(PH )(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。在機(jī)械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細(xì)胞破裂，DNA從細(xì)胞核釋放到提取緩沖液中。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。七、思考題影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？主要參考文獻(xiàn)，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。大量元素(10倍液)ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)ml 鐵鹽（100倍）ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）ml 蔗糖g 瓊脂 g（三）接種與培養(yǎng)在超凈臺(tái)上接種后，用記號(hào)筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。注: 需要溶解完一個(gè)再加另一個(gè)；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時(shí)可以加熱。配制過程中產(chǎn)生沉淀的原因有：； 值過高，可加幾滴鹽酸校正。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細(xì)胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。五、思考題根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所選擇及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。，滅菌時(shí)間。四、選擇題：從備選答案中選出正確的結(jié)果，正確答案是唯一的。______標(biāo)記。，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍(lán)、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異，再生植株產(chǎn)生的變異主要有＿、＿、＿、＿。，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢測(cè)方法正確，則下列基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。、基因槍介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道法、無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。，通過觀察特異性條帶而對(duì)這些病原進(jìn)行鑒定。，而花粉培養(yǎng)則屬于器官培養(yǎng)的范疇。，往往不能進(jìn)行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其他成份經(jīng)高壓滅菌后放置于無菌場(chǎng)所，若制備半固態(tài)培養(yǎng)基，須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，再加入經(jīng)過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。，常采用酶解的方法脫除細(xì)胞壁。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。？。Ant D:GFP：（）A：免疫注射 B：細(xì)胞融合 C：篩選 D：克隆化：（）Ａ：準(zhǔn)備室 Ｂ：制備室 Ｃ：無菌操作室 Ｄ：培養(yǎng)室:()A：有性雜交 B：體細(xì)胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克?。海ǎ粒悍N質(zhì)資源保存 Ｂ：原生質(zhì)體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉(zhuǎn)化：（）A：對(duì)稱融合 B：非對(duì)稱融合 C：配子—體細(xì)胞融合 D：：（）A：兩側(cè)的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ :（）A：血清學(xué)檢測(cè) B：PCR檢測(cè) C：同工酶檢測(cè) D：指示植物鑒定：（）A：黃龍病 B：裂皮病 C：線蟲病 D：速衰病’ATCG TACG GGTT3’，則能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：（）A：5’ATCG TACG GGTT3’ B：5’AACC CGTA CGAT3’ C：3’TAGC ATGC CCAA5’ D：3’UAGC AUGC CCAA5’：（）A：ELISA B：Southern雜交 C：Western雜交 D：Northern雜交：（）A：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 B：基因槍法 C：PEG轉(zhuǎn)化法 D：電泳法，主要表現(xiàn)在：（）Ａ：搶救發(fā)育不良或早期退化胚 Ｂ：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和 Ｃ：用于柑橘合子胚搶救 Ｄ：三倍體育種：（）A：脫毒與快速繁殖 B：花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng) C：胚搶救技術(shù) C：細(xì)胞融合技術(shù)：（）Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態(tài)五、簡(jiǎn)答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。；組織培養(yǎng)中外植體再生的兩種主要途徑是_______和_______。，影響原生質(zhì)體的主要因素有＿、＿、＿、＿。，大多數(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)相似。、GUS、Ant、Luc、AFLP等?，F(xiàn)有一傳統(tǒng)品種，