新人教版生物選修1課題3《血紅蛋白的提取和分離》之一(文件)
【正文】 的的橡皮塞，中間打孔； b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的（ ），在 （ ）頭部切下（ ）長的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。 ③ 頂塞的制作： 插入安裝了玻璃管的橡皮塞 ④ 組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體 。 蒸餾水 凝膠懸浮液 交聯(lián)葡聚糖凝膠① 固定：將色譜柱處置固定在支架上 ② 裝填： 將（ ） 一次性的緩慢倒入（ ）內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。 洗滌平衡注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。 思考 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 ③ 用于制備分離膠和濃縮膠的 Tris緩沖液 ④ TEMED ：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。 ⑦ 樣品處理液 50 mmol/L Tris— HCl(pH )， 100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇 )或用 5%的巰基乙醇， 2%的 SDS， %的溴酚藍， 10%的甘油。因此在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。用去離子水 mL， 30%的丙烯酰胺 mL， mol、 pH Tris緩沖液 mL， 10%的 mL， 10%的過硫酸胺 mL， TEMED mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。 3）樣品處理 5)加樣 在電泳樣品中按 1∶1 體積比加入樣品處理液，在 100 ℃ 溫度下加熱 3 min，以使蛋白質(zhì)變性。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。 6)電泳 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為 8 V/cm。 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖 518），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售 。 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 三 實驗結(jié)果分析與評價 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 10)觀察結(jié)果： SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與 SDS的結(jié)合程度。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標注凝膠的方位。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞破碎后(即進行凝膠色譜分離之前 )的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品 4）濃縮膠聚合完全后（ 30 min），小心移出梳子。然后再補加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。 ① SDS聚丙烯酰胺 分離膠制備 1)根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板 2） SDS— 聚丙烯酰胺凝膠 制備 用去離子水 mL， 30%的丙烯酰胺 mL，、 pH Tris緩沖液 mL， 10%的SDS mL， 10%的過硫酸胺 mL， TEMED ，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間 (梳子的齒長再加 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高 2— 3 mm），以阻止氧氣進入凝膠溶液。 由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進行。此溶液須配制新鮮液。 思考 樣品的粗分離 純化 純度鑒定 －聚丙烯酰胺凝膠電泳 判斷（ ）的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1