實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)(文件)
【正文】 以通過(guò)有限的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)染直接誘導(dǎo)各種不同動(dòng)物的體細(xì)胞來(lái)獲取多能性干細(xì)胞，而不需要通過(guò) ES細(xì)胞 途徑，克服了許多動(dòng)物至今未分離出 ES細(xì)胞 的問(wèn)題。 ② 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ， 感染受體細(xì)胞時(shí) ， 外源基因可整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi) 。 ： ① 電穿孔法： 細(xì)胞暴露于高電壓時(shí) ， 細(xì)胞膜為高電壓瞬時(shí)擊穿 ， 從而使外源 DNA被攝入細(xì)胞中 。究竟哪一個(gè)親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細(xì)胞是否在嵌合體動(dòng)物體內(nèi)分化成生殖細(xì)胞（精子或卵子）。 61 將帶有外源基因的體細(xì)胞作為供體，通過(guò)核移植技術(shù)克隆到去核卵母細(xì)胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕 動(dòng)物 的子宮中。 游離的未整合外源 DNA只要有真核細(xì)胞能識(shí)別的 啟動(dòng)子 、 編碼基因以及 poly(A)信號(hào) 等 ， 一般都能得到表達(dá) ， 但隨著細(xì)胞衰老 ， 表達(dá)力下降 。 63 DNA構(gòu)件導(dǎo)入細(xì)胞的方法 顯微注射法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因 電穿孔 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 生殖細(xì)胞或早期胚胎 ES細(xì)胞 體細(xì)胞 隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合或隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合或 隨機(jī)整合 64 外源基因整合到受體細(xì)胞染色體可分為以下兩種情況： ① 隨機(jī)插入 （ Random insertion） ： 外源基因進(jìn)入細(xì)胞后 ， 隨機(jī)插入到任意的染色體內(nèi) 。 當(dāng)外源基因載體進(jìn)入細(xì)胞后 ， 同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近 ， 通過(guò)同源重組 ， 將外源基因載體置換到染色體相應(yīng)的位置上 ， 實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)整合 。該基因序列可以與細(xì)胞基因組內(nèi)的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后的基因 置換 到基因組內(nèi)，實(shí)現(xiàn)靶基因敲除、替換或改造。 69 用正負(fù)篩選法篩選定點(diǎn)整合細(xì)胞 正篩選用 Neor基因： 新霉素抗性基因 當(dāng)帶有 Neor基因的打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，未整合 Neor基因的細(xì)胞被培養(yǎng)液中的 G418（新霉素的衍生物）殺死，而整合到宿主細(xì)胞的 Neor基因?qū)ε囵B(yǎng)液中的 G418產(chǎn)生耐藥性，存活下來(lái)形成細(xì)胞克隆。如果發(fā)生同源重組，由于 tk基因在同源區(qū)之外不能整合，斷裂脫落，因而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有影響。 。 71 隨機(jī)整合和定點(diǎn)整合的不同點(diǎn) 隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合 同義詞 隨機(jī)插入 基因打靶、同源重組 外源基因構(gòu)件 無(wú)需同源臂，外源基因需啟動(dòng)子、編碼基因和 polyA信號(hào) 需同源臂和正負(fù)篩選基因 細(xì)胞 受精卵或早期胚胎 ES細(xì)胞或體細(xì)胞 外源基因?qū)敕椒? 顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法 電穿孔法或脂質(zhì)體法 插入部位 隨機(jī)，無(wú)法控制 絕大多數(shù)隨機(jī)整合，只有極少數(shù)發(fā)生同源重組 篩選 無(wú)法篩選 細(xì)胞水平通過(guò)正負(fù)篩選篩選出定點(diǎn)整合細(xì)胞 胚胎移植 直接胚胎移植 須經(jīng)囊胚內(nèi)注射或核移植階段再進(jìn)行胚胎移植 72 復(fù)習(xí)題 思考題 、體外受精、胚胎分割、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎冷凍保存的基本概念。 正常細(xì)胞 細(xì)胞死亡 定點(diǎn)整合 細(xì)胞存活 隨機(jī)插入 細(xì)胞存活 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 70 正常細(xì)胞 細(xì)胞存活 定點(diǎn)整合 細(xì)胞存活 隨機(jī)插入 細(xì)胞死亡 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 GANC培養(yǎng)液 ? 負(fù)篩選用 tk基因： HSV胸腺激酶基因 HSVtk+基因產(chǎn)物可使培養(yǎng)液中的 Ganc轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使細(xì)胞死亡。 1 neo tk 3 1 2 3 1 neo 3 載體 基因組 位 點(diǎn) 68 如何在體外篩選定點(diǎn)整合的供體細(xì)胞和 ES細(xì)胞？ ?采用正負(fù)篩選法 正篩選：用 Neor基因（新霉素抗性基因） 殺死沒(méi)有 Neor基因的細(xì)胞 負(fù)篩選：用 tk基因（ HSV胸腺激酶基因） 有 tk基因的細(xì)胞可使培養(yǎng)液中 的 Ganc轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使 細(xì)胞死亡。 65 ? 隨機(jī)整合（ Random insertion） 外源基因隨機(jī)插入到染色體的任意部位。 另外 ， 插入外源基因受鄰近調(diào)控序列的影響 ， 其表達(dá)可能高 ， 也可能低 。 3． 整合到受體細(xì)胞染色體 （ 只有少數(shù) ） 。 62 ? 外源基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn) 外源 DNA進(jìn)入細(xì)胞后有三種命運(yùn)： 1． 被胞內(nèi)酶降解 。 60 ?嵌合體動(dòng)物的制備： 法 用聚合法制作嵌合體動(dòng)物 ，是將遺傳上不同 （ 例如毛色不同 ） 的兩個(gè) 8～ 16細(xì)胞胚胎用物理方法聚合起來(lái) 。 ③ 基因槍法： ④ DEAE葡聚糖介導(dǎo)法： ⑤ 磷酸鈣介導(dǎo)法： 59 ES細(xì)胞 通過(guò)崁合體技術(shù)進(jìn)入囊胚 胚胎嵌合是指將遺傳上不同的兩類胚胎或胚細(xì)胞組合起來(lái)，由此而發(fā)育形成的動(dòng)物稱為嵌合體動(dòng)物。 ③ 精子載體法： 將外源 DNA與動(dòng)物精子一起孵育 ， 在體外受精過(guò)程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi) 。 目前 , 科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得 iPS 細(xì)胞。 20天后，一只黑色的小老鼠出生。 53 四、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 iPS 細(xì)胞建立的過(guò)程主要包括 : ① 分離和培養(yǎng)宿主細(xì)胞； ② 通過(guò)病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方式將若干個(gè)多能性相關(guān)的基因 （ Oct Sox cMyc 和 Klf4） 導(dǎo)入宿主細(xì)胞； ③ 將病毒感染后的細(xì)胞種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞上 , 用 ES細(xì)胞 專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng) , 同時(shí)在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子化合物，以促進(jìn)重編程。 所有干細(xì)胞中，來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為
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