實驗動物胚胎工程技術(文件)
【正文】 以通過有限的幾個轉錄因子基因轉染直接誘導各種不同動物的體細胞來獲取多能性干細胞，而不需要通過 ES細胞 途徑，克服了許多動物至今未分離出 ES細胞 的問題。 ② 逆轉錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉錄病毒載體 ， 感染受體細胞時 ， 外源基因可整合到宿主細胞染色體內(nèi) 。 ： ① 電穿孔法： 細胞暴露于高電壓時 ， 細胞膜為高電壓瞬時擊穿 ， 從而使外源 DNA被攝入細胞中 。究竟哪一個親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細胞是否在嵌合體動物體內(nèi)分化成生殖細胞（精子或卵子）。 61 將帶有外源基因的體細胞作為供體，通過核移植技術克隆到去核卵母細胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕 動物 的子宮中。 游離的未整合外源 DNA只要有真核細胞能識別的 啟動子 、 編碼基因以及 poly(A)信號 等 ， 一般都能得到表達 ， 但隨著細胞衰老 ， 表達力下降 。 63 DNA構件導入細胞的方法 顯微注射法 逆轉錄病毒感染 精子介導轉基因 電穿孔 電穿孔 脂質(zhì)體轉染 磷酸鈣轉染 生殖細胞或早期胚胎 ES細胞 體細胞 隨機整合 定點整合或隨機整合 定點整合或 隨機整合 64 外源基因整合到受體細胞染色體可分為以下兩種情況： ① 隨機插入 （ Random insertion） ： 外源基因進入細胞后 ， 隨機插入到任意的染色體內(nèi) 。 當外源基因載體進入細胞后 ， 同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近 ， 通過同源重組 ， 將外源基因載體置換到染色體相應的位置上 ， 實現(xiàn)了定點整合 。該基因序列可以與細胞基因組內(nèi)的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后的基因 置換 到基因組內(nèi)，實現(xiàn)靶基因敲除、替換或改造。 69 用正負篩選法篩選定點整合細胞 正篩選用 Neor基因： 新霉素抗性基因 當帶有 Neor基因的打靶載體轉染細胞，未整合 Neor基因的細胞被培養(yǎng)液中的 G418（新霉素的衍生物）殺死，而整合到宿主細胞的 Neor基因?qū)ε囵B(yǎng)液中的 G418產(chǎn)生耐藥性，存活下來形成細胞克隆。如果發(fā)生同源重組，由于 tk基因在同源區(qū)之外不能整合，斷裂脫落，因而對細胞沒有影響。 。 71 隨機整合和定點整合的不同點 隨機整合 定點整合 同義詞 隨機插入 基因打靶、同源重組 外源基因構件 無需同源臂，外源基因需啟動子、編碼基因和 polyA信號 需同源臂和正負篩選基因 細胞 受精卵或早期胚胎 ES細胞或體細胞 外源基因?qū)敕椒? 顯微注射法、逆轉錄病毒法 電穿孔法或脂質(zhì)體法 插入部位 隨機，無法控制 絕大多數(shù)隨機整合，只有極少數(shù)發(fā)生同源重組 篩選 無法篩選 細胞水平通過正負篩選篩選出定點整合細胞 胚胎移植 直接胚胎移植 須經(jīng)囊胚內(nèi)注射或核移植階段再進行胚胎移植 72 復習題 思考題 、體外受精、胚胎分割、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎冷凍保存的基本概念。 正常細胞 細胞死亡 定點整合 細胞存活 隨機插入 細胞存活 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 70 正常細胞 細胞存活 定點整合 細胞存活 隨機插入 細胞死亡 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 GANC培養(yǎng)液 ? 負篩選用 tk基因： HSV胸腺激酶基因 HSVtk+基因產(chǎn)物可使培養(yǎng)液中的 Ganc轉變成一種有毒物質(zhì)使細胞死亡。 1 neo tk 3 1 2 3 1 neo 3 載體 基因組 位 點 68 如何在體外篩選定點整合的供體細胞和 ES細胞？ ?采用正負篩選法 正篩選：用 Neor基因（新霉素抗性基因） 殺死沒有 Neor基因的細胞 負篩選：用 tk基因（ HSV胸腺激酶基因） 有 tk基因的細胞可使培養(yǎng)液中 的 Ganc轉變成一種有毒物質(zhì)使 細胞死亡。 65 ? 隨機整合（ Random insertion） 外源基因隨機插入到染色體的任意部位。 另外 ， 插入外源基因受鄰近調(diào)控序列的影響 ， 其表達可能高 ， 也可能低 。 3． 整合到受體細胞染色體 （ 只有少數(shù) ） 。 62 ? 外源基因進入細胞后的命運 外源 DNA進入細胞后有三種命運： 1． 被胞內(nèi)酶降解 。 60 ?嵌合體動物的制備： 法 用聚合法制作嵌合體動物 ，是將遺傳上不同 （ 例如毛色不同 ） 的兩個 8～ 16細胞胚胎用物理方法聚合起來 。 ③ 基因槍法： ④ DEAE葡聚糖介導法： ⑤ 磷酸鈣介導法： 59 ES細胞 通過崁合體技術進入囊胚 胚胎嵌合是指將遺傳上不同的兩類胚胎或胚細胞組合起來，由此而發(fā)育形成的動物稱為嵌合體動物。 ③ 精子載體法： 將外源 DNA與動物精子一起孵育 ， 在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi) 。 目前 , 科學家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人的體細胞中誘導并獲得 iPS 細胞。 20天后，一只黑色的小老鼠出生。 53 四、誘導性多潛能干細胞 iPS 細胞建立的過程主要包括 : ① 分離和培養(yǎng)宿主細胞； ② 通過病毒介導或基因轉染的方式將若干個多能性相關的基因 （ Oct Sox cMyc 和 Klf4） 導入宿主細胞； ③ 將病毒感染后的細胞種植于飼養(yǎng)層細胞上 , 用 ES細胞 專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng) , 同時在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應的小分子化合物，以促進重編程。 所有干細胞中，來源于骨髓的干細胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為
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