實驗動物胚胎工程技術(shù)(存儲版)
【正文】 2 ? 核移植 （ Nuclear transfer） 是指將動物細胞的細胞核移植到另一個體的去核卵母細胞胞質(zhì)中 ， 通過電激活 ， 使供體核重編程序 ， 形成的重構(gòu)卵發(fā)育成胚胎 ， 最后通過胚胎移植 ， 使之發(fā)育成個體 。他們通過慢病毒載體介導(dǎo)將 Oct Sox cMyc 和 Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子基因 導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細胞 , 獲得了具有強大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細胞 , 命名為 “誘導(dǎo)性多潛能干細胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細胞 )。 42 目前除了從 小鼠、大鼠 和人 分離得到并建立 ES細胞系外，還未從其它動物的囊胚中分離到 ES細胞系?；チ鰞?nèi)部有多種細胞生長，如上皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、成纖維細胞以及干細胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 46 ES細胞僅在飼養(yǎng)層細胞上或在添加白血病抑制因子 (LIF)或白細胞介素 6(IL6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。 49 ，用于器官移植 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過 ES細胞體外誘導(dǎo)分化，還可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。 所有干細胞中，來源于骨髓的干細胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為 造血干細胞 (HSC)和骨髓間質(zhì)干細胞 (MSC)。 20天后，一只黑色的小老鼠出生。 ③ 精子載體法： 將外源 DNA與動物精子一起孵育 ， 在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi) 。 60 ?嵌合體動物的制備： 法 用聚合法制作嵌合體動物 ，是將遺傳上不同 （ 例如毛色不同 ） 的兩個 8～ 16細胞胚胎用物理方法聚合起來 。 3． 整合到受體細胞染色體 （ 只有少數(shù) ） 。 65 ? 隨機整合（ Random insertion） 外源基因隨機插入到染色體的任意部位。 正常細胞 細胞死亡 定點整合 細胞存活 隨機插入 細胞存活 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 70 正常細胞 細胞存活 定點整合 細胞存活 隨機插入 細胞死亡 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 GANC培養(yǎng)液 ? 負篩選用 tk基因： HSV胸腺激酶基因 HSVtk+基因產(chǎn)物可使培養(yǎng)液中的 Ganc轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使細胞死亡。 。 69 用正負篩選法篩選定點整合細胞 正篩選用 Neor基因： 新霉素抗性基因 當帶有 Neor基因的打靶載體轉(zhuǎn)染細胞，未整合 Neor基因的細胞被培養(yǎng)液中的 G418（新霉素的衍生物）殺死，而整合到宿主細胞的 Neor基因?qū)ε囵B(yǎng)液中的 G418產(chǎn)生耐藥性，存活下來形成細胞克隆。 當外源基因載體進入細胞后 ， 同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近 ， 通過同源重組 ， 將外源基因載體置換到染色體相應(yīng)的位置上 ， 實現(xiàn)了定點整合 。 游離的未整合外源 DNA只要有真核細胞能識別的 啟動子 、 編碼基因以及 poly(A)信號 等 ， 一般都能得到表達 ， 但隨著細胞衰老 ， 表達力下降 。究竟哪一個親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細胞是否在嵌合體動物體內(nèi)分化成生殖細胞（精子或卵子）。 ② 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ， 感染受體細胞時 ， 外源基因可整合到宿主細胞染色體內(nèi) 。 iPS 細胞的鑒定與 ES細胞 相同。 通常情況下，供體干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。利用 ES細胞可以誘導(dǎo)分化形成新的組織 細胞的特性，移植 ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能。 45 （四）胚胎干細胞的應(yīng)用 由于 ES細胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層中任何一種類型細胞，因此可用遺傳標記的 ES細胞 (如標記半乳糖苷酶基因 )注入囊胚腔，通過組織化學(xué)染色追蹤 ES細胞的分化特點，探索胚胎發(fā)育過程中細胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。在建系之初需要對其核型 、 分化能力和細胞標志物進行鑒定 1．核型 2．體外分化試驗 將 ES細胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（ embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細胞團；向成纖維細胞、心肌細胞以及造血細胞的分化。 ? 由于內(nèi)細胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細胞被認為具有 全能性。 AS細胞 是 ES細胞 定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細胞的“專能”細胞，包括神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、精原干細胞、皮膚干細胞和肝臟干細胞等。 無性生殖在植物中很常見，在動物中過去認為是不可能的。 ? 低溫損傷：如果冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液濃度提高，胞內(nèi)水分大量滲出，導(dǎo)致細胞的強烈收縮和細胞處于高濃度的溶液中時間過長，從而造成 化學(xué)損傷 ；如果冷卻速度過快，胞內(nèi)水分來不及通過細胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液過冷而結(jié)冰，從而造成 物理損傷 。 不同發(fā)育階段的胚胎移植的部位不同。 3．冷凍保存胚胎解凍后，通過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。即 X精子帶上正電荷， Y精子帶上負電荷。 16 （一）分離 X精子與 Y精子以控制性別 分離 X精子與 Y精子的依據(jù) ： X、 Y精子在體積 、密度 、 電荷 、 運動性和 DNA含量 、 表面抗原等方面存在差異 。 這一過程包括卵母細胞的收集或未成熟卵母細胞的培養(yǎng)成熟 、 精子的獲取 、 獲能處理 、 受精及受精后胚胎培養(yǎng)等 。將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。1 第十二章
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