【正文】 他胚細胞注入桑椹胚或囊胚腔中來制作嵌合體動物。 插入到致死基因序列內(nèi)：胚胎死亡 插入到功能基因序列內(nèi)：基因失活 插入到調(diào)控區(qū)下游：外源基因表達增強 /減弱 66 ? 定點整合（ targeted integration） 同義詞：基因打靶（ Gene targeting） 是指將基因組的某一基因序列克隆出來并加以改造，再導(dǎo)入同種細胞內(nèi)。 ？根據(jù)發(fā)育階段，干細胞可分為哪兩類？ iPS? iPS的實際應(yīng)用意義是什么？ ，細胞核移植包括哪幾種？一般所說的 “ 克隆 ” 是指那一種？ ？ ，什么叫定點整合？ 。 ② 定點整合 （ Targeted integration） ： 實現(xiàn)定點整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點整合部位的同源DNA序列 ， 即所謂的 同源臂 （ Homologous arm） 。由于嵌合體動物是兩類遺傳背景不同的胚胎發(fā)育形成的，不同細胞群體互相嵌合構(gòu)成了器官和組織，但嵌合體動物攜帶的兩種遺傳特性不能同時遺傳給下一代的同一個體。 其培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)定向分化的條件基本與 ES細胞 相同。 48 4. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學(xué)上尚未攻克的頑癥。 44 （ 三 ） ES細胞的鑒定 ? ES細胞是一種正常的胚胎性干細胞 ， 具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能 。 ES細胞 存在于 囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團 中，是全能性、無限增殖的干細胞，在胚胎的生長發(fā)育過程中具有分化形成胎兒所有類型細胞、組織和器官的潛能。并且溫度越低，保存時間就越長。 2．受精卵通過體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷凍保存。 三、胚胎性別控制 15 性別控制技術(shù) 1. 通過對 X精子與 Y精子分離以控制性別 2. 在胚胎移植前對胚胎的性別進行鑒定以控制性別 3. 通過控制飼料特性、受精環(huán)境如改變精液或陰道的 PH值等來控制性別。 7 第二節(jié) 胚胎操作基本技術(shù) 8 胚胎操作的整個過程局限在胚胎的早期發(fā)育 9 解剖取附睪尾部 精子的獲取和培養(yǎng) ?嚙齒類小動物精子的采集大都從 體成熟雄性動物 的附睪獲取。將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 16 （一）分離 X精子與 Y精子以控制性別 分離 X精子與 Y精子的依據(jù) ： X、 Y精子在體積 、密度 、 電荷 、 運動性和 DNA含量 、 表面抗原等方面存在差異 。 3．冷凍保存胚胎解凍后，通過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。 ? 低溫損傷：如果冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液濃度提高，胞內(nèi)水分大量滲出，導(dǎo)致細胞的強烈收縮和細胞處于高濃度的溶液中時間過長，從而造成 化學(xué)損傷 ；如果冷卻速度過快，胞內(nèi)水分來不及通過細胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液過冷而結(jié)冰，從而造成 物理損傷 。 AS細胞 是 ES細胞 定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細胞的“專能”細胞，包括神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、精原干細胞、皮膚干細胞和肝臟干細胞等。在建系之初需要對其核型 、 分化能力和細胞標志物進行鑒定 1．核型 2．體外分化試驗 將 ES細胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（ embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細胞團；向成纖維細胞、心肌細胞以及造血細胞的分化。利用 ES細胞可以誘導(dǎo)分化形成新的組織 細胞的特性，移植 ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能。 iPS 細胞的鑒定與 ES細胞 相同。究竟哪一個親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細胞是否在嵌合體動物體內(nèi)分化成生殖細胞（精子或卵子）。 當(dāng)外源基因載體進入細胞后 ， 同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近 ， 通過同源重組 ， 將外源基因載體置換到染色體相應(yīng)的位置上 ， 實現(xiàn)了定點整合 。 。 65 ? 隨機整合（ Random insertion） 外源基因隨機插入到染色體的任意部位。 60 ?嵌合體動物的制備： 法 用聚合法制作嵌合體動物 ，是將遺傳上不同 （ 例如毛色不同 ） 的兩個 8～ 16細胞胚胎用物理方法聚合起來 。 20天后，一只黑色的小老鼠出生。 49 ，用于器官移植 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過 ES細胞體外誘導(dǎo)分化，還可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題?；チ鰞?nèi)部有多種細胞生長，如上皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、成纖維細胞以及干細胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。他們通過慢病毒載體介導(dǎo)將 Oct Sox cMyc 和 Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子基因 導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細胞 , 獲得了具有強大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細胞 , 命名為 “誘導(dǎo)性多潛能干細胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細胞 )。 28 ? 采用低溫保護劑防止低溫損傷： 二甲基亞砜（ DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮 (pvp)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（ HES）等可以避免或減少結(jié)冰的程度與速度，降低細胞周圍未凍結(jié)溶液中的電解質(zhì)濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過程中所發(fā)生的物理和化學(xué)損傷。 目前胚胎培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)可以將未成熟卵在體外成熟，并通過體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。 目前將 X和 Y精子分離的方法有沉降法 、 電泳法 、免疫法和流式細胞儀法等 。 一、精子、卵母細胞、受精