實驗動物胚胎工程技術(shù)(編輯修改稿)
2024-10-08 20:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ES細胞 體外定向培養(yǎng)成特定細胞 再生醫(yī)學技術(shù)路線簡介 37 第四節(jié) 干細胞技術(shù) 38 一、概述 干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞。根據(jù)發(fā)育階段，可將干細胞分為 胚胎干細胞(embryonic stem cells， ES細胞 )和 成體干細胞 (adult stem cells， AS細胞 )。 ES細胞 存在于 囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團 中，是全能性、無限增殖的干細胞，在胚胎的生長發(fā)育過程中具有分化形成胎兒所有類型細胞、組織和器官的潛能。 AS細胞 是 ES細胞 定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細胞的“專能”細胞，包括神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、精原干細胞、皮膚干細胞和肝臟干細胞等。 39 40 誘導性多潛能干細胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細胞 ) 2022 年 , Takahashi 等首次發(fā)現(xiàn)導入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因能夠使已分化的細胞重編程回歸到胚胎細胞狀態(tài)。他們通過慢病毒載體介導將 Oct Sox cMyc 和 Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子基因 導入小鼠皮膚成纖維細胞 , 獲得了具有強大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細胞 , 命名為 “誘導性多潛能干細胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細胞 )。這一研究克服了 ES細胞 和 AS細胞 應(yīng)用存在的諸多問題，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，受到了整個生命科學領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前研究中較為理想的供體細胞主要有血細胞 (如 T 細胞和 B 細胞等 )、脂肪細胞和皮膚成纖維細胞。 41 二、胚胎干細胞（ ES細胞 ) ?來源： ES細胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約 57天，小鼠胚胎受精后 34天）中 的內(nèi)細胞群 分離出來的未分化細胞。 ? 內(nèi)細胞群 :具有未分化特性，可進一步分裂 ,分化形成內(nèi)、中、外三個胚層。 外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等， 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織， 內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。 ? 由于內(nèi)細胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細胞被認為具有 全能性。當內(nèi)細胞群分離出來后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，我們稱之為 ES細胞。 42 目前除了從 小鼠、大鼠 和人 分離得到并建立 ES細胞系外，還未從其它動物的囊胚中分離到 ES細胞系。 43 （ 二 ） ES細胞的培養(yǎng) ? ES細胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對培養(yǎng)液、試劑、胎牛血清、水等均需采用胚胎級，對培養(yǎng)器皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合， ES細胞容易發(fā)生分化，從而失去 ES細胞的特性。 ? 未分化 ES細胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素處理過的成纖維細胞飼養(yǎng)層（ Feeder cell）共培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細胞為 ES細胞提供細胞因子來維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（ Leukemia Inhibitory Factor， LIF）能更有效地維持未分化的 ES細胞。 44 （ 三 ） ES細胞的鑒定 ? ES細胞是一種正常的胚胎性干細胞 ， 具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能 。在建系之初需要對其核型 、 分化能力和細胞標志物進行鑒定 1．核型 2．體外分化試驗 將 ES細胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（ embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細胞團；向成纖維細胞、心肌細胞以及造血細胞的分化。 3．體內(nèi)分化試驗 將 ES細胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下， 2周后注射部位出現(xiàn)腫塊，病理檢查為畸胎瘤。畸胎瘤內(nèi)部有多種細胞生長，如上皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、成纖維細胞以及干細胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 4． ES細胞的標志物 ? Oct4: Oct4（ 也叫 Oct3或 Oct3/4） 屬 POU轉(zhuǎn)錄因子一員 ， 它在全能胚胎干細胞 (ES)和生殖細胞表達 。 該表達對于維持干細胞的自我更新和多能性是必要的 。 ES的分化導致 Oct4的下調(diào) 。 ? SSEAs: 人 ES細胞表達 SSEA3和 SSEA4， 但不表達 SSEA1。 小鼠 ES細胞表達SSEA1， 但不表達 SSEA3或 SSEA4。 45 （四）胚胎干細胞的應(yīng)用 由于 ES細胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層中任何一種類型細胞，因此可用遺傳標記的 ES細胞 (如標記半乳糖苷酶基因 )注入囊胚腔，通過組織化學染色追蹤 ES細胞的分化特點，探索胚胎發(fā)育過程中細胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的ES細胞已成為研究哺乳動物早期發(fā)育規(guī)律的重要工具之一。 46 ES細胞僅在飼養(yǎng)層細胞上或在添加白血病抑制因子 (LIF)或白細胞介素 6(IL6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當培養(yǎng)液中添加分化誘導劑，如牛黃酸 (RA)、二甲基亞砜 (DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和 3甲氧基苯甲酰胺等，可誘導 ES細胞發(fā)生不同類型的分化，通過研究 ES的分化特點可揭示細胞分化和凋亡機理。 47 由于用 ES細胞可進行基因打靶，容易獲得基因敲除或定向插入外源基因的 ES細胞，因此是基因敲除和基因插入的首選細胞。 通過篩選獲得陽性細胞，然后用嵌合體或細胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物。用于研究未知基因的生物學功能。 48 4. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學上尚未攻克的頑癥。利用 ES細胞可以誘導分化形成新的組織 細胞的特性，移植 ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能
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