實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)(編輯修改稿)
2024-10-08 20:53 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ES細(xì)胞 體外定向培養(yǎng)成特定細(xì)胞 再生醫(yī)學(xué)技術(shù)路線簡(jiǎn)介 37 第四節(jié) 干細(xì)胞技術(shù) 38 一、概述 干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段，可將干細(xì)胞分為 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells， ES細(xì)胞 )和 成體干細(xì)胞 (adult stem cells， AS細(xì)胞 )。 ES細(xì)胞 存在于 囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán) 中，是全能性、無(wú)限增殖的干細(xì)胞，在胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有分化形成胎兒所有類型細(xì)胞、組織和器官的潛能。 AS細(xì)胞 是 ES細(xì)胞 定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細(xì)胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細(xì)胞的“專能”細(xì)胞，包括神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、精原干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞等。 39 40 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細(xì)胞 ) 2022 年 , Takahashi 等首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因能夠使已分化的細(xì)胞重編程回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)。他們通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)將 Oct Sox cMyc 和 Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子基因 導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞 , 獲得了具有強(qiáng)大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細(xì)胞 , 命名為 “誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細(xì)胞 )。這一研究克服了 ES細(xì)胞 和 AS細(xì)胞 應(yīng)用存在的諸多問(wèn)題，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，受到了整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前研究中較為理想的供體細(xì)胞主要有血細(xì)胞 (如 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞等 )、脂肪細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞。 41 二、胚胎干細(xì)胞（ ES細(xì)胞 ) ?來(lái)源： ES細(xì)胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約 57天，小鼠胚胎受精后 34天）中 的內(nèi)細(xì)胞群 分離出來(lái)的未分化細(xì)胞。 ? 內(nèi)細(xì)胞群 :具有未分化特性，可進(jìn)一步分裂 ,分化形成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層。 外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等， 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織， 內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。 ? 由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有 全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群分離出來(lái)后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，我們稱之為 ES細(xì)胞。 42 目前除了從 小鼠、大鼠 和人 分離得到并建立 ES細(xì)胞系外，還未從其它動(dòng)物的囊胚中分離到 ES細(xì)胞系。 43 （ 二 ） ES細(xì)胞的培養(yǎng) ? ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對(duì)培養(yǎng)液、試劑、胎牛血清、水等均需采用胚胎級(jí)，對(duì)培養(yǎng)器皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合， ES細(xì)胞容易發(fā)生分化，從而失去 ES細(xì)胞的特性。 ? 未分化 ES細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素處理過(guò)的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（ Feeder cell）共培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細(xì)胞為 ES細(xì)胞提供細(xì)胞因子來(lái)維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（ Leukemia Inhibitory Factor， LIF）能更有效地維持未分化的 ES細(xì)胞。 44 （ 三 ） ES細(xì)胞的鑒定 ? ES細(xì)胞是一種正常的胚胎性干細(xì)胞 ， 具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能 。在建系之初需要對(duì)其核型 、 分化能力和細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行鑒定 1．核型 2．體外分化試驗(yàn) 將 ES細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（ embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細(xì)胞團(tuán)；向成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及造血細(xì)胞的分化。 3．體內(nèi)分化試驗(yàn) 將 ES細(xì)胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下， 2周后注射部位出現(xiàn)腫塊，病理檢查為畸胎瘤?；チ鰞?nèi)部有多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及干細(xì)胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 4． ES細(xì)胞的標(biāo)志物 ? Oct4: Oct4（ 也叫 Oct3或 Oct3/4） 屬 POU轉(zhuǎn)錄因子一員 ， 它在全能胚胎干細(xì)胞 (ES)和生殖細(xì)胞表達(dá) 。 該表達(dá)對(duì)于維持干細(xì)胞的自我更新和多能性是必要的 。 ES的分化導(dǎo)致 Oct4的下調(diào) 。 ? SSEAs: 人 ES細(xì)胞表達(dá) SSEA3和 SSEA4， 但不表達(dá) SSEA1。 小鼠 ES細(xì)胞表達(dá)SSEA1， 但不表達(dá) SSEA3或 SSEA4。 45 （四）胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用 由于 ES細(xì)胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層中任何一種類型細(xì)胞，因此可用遺傳標(biāo)記的 ES細(xì)胞 (如標(biāo)記半乳糖苷酶基因 )注入囊胚腔，通過(guò)組織化學(xué)染色追蹤 ES細(xì)胞的分化特點(diǎn)，探索胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的ES細(xì)胞已成為研究哺乳動(dòng)物早期發(fā)育規(guī)律的重要工具之一。 46 ES細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在添加白血病抑制因子 (LIF)或白細(xì)胞介素 6(IL6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑，如牛黃酸 (RA)、二甲基亞砜 (DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和 3甲氧基苯甲酰胺等，可誘導(dǎo) ES細(xì)胞發(fā)生不同類型的分化，通過(guò)研究 ES的分化特點(diǎn)可揭示細(xì)胞分化和凋亡機(jī)理。 47 由于用 ES細(xì)胞可進(jìn)行基因打靶，容易獲得基因敲除或定向插入外源基因的 ES細(xì)胞，因此是基因敲除和基因插入的首選細(xì)胞。 通過(guò)篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，然后用嵌合體或細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用于研究未知基因的生物學(xué)功能。 48 4. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細(xì)胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學(xué)上尚未攻克的頑癥。利用 ES細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化形成新的組織 細(xì)胞的特性，移植 ES細(xì)胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能
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