基因工程育種碩士課程(文件)
【正文】 入。 （ 三 ） 基因槍法 基 因 槍 法 又 稱 微 彈 轟 擊 法 （ Microprojectile bombardment） ,自 Klein TM等 1987年首次利用鎢粒對洋蔥的組織進行轟擊試驗以來 ， 已被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化 。 （四） 限制 性 酶介導(dǎo)的 DNA整合法 這是九十年代發(fā)展起來的一種能較大幅度提高轉(zhuǎn)化率的方法，其英文為 Restriction EnzymeMediated DNA Integration， 簡稱 REMI 。該法亦可作為 REMI標(biāo)簽對功能基因進行分離。 五 . 基因定位誘變 ? 定位誘變方法 ? 刪除法 ： 在目的基因中刪除一個或若干個堿基序列，使基因發(fā)生重排而造成其性狀的改變。 1) 特定的 G:C變 A:T 2) 錯配取代 ? 將變異基因送回染色體 1）體內(nèi)自發(fā)的同源重組； 2）定位整合作用 六 . 基因工程育種實例 耐寒凍轉(zhuǎn)基因草菇的培育 草菇的特點： ，不耐低溫 ,菌絲在 4℃ 低 溫下2d即自溶而死亡； 4℃ 低溫下 24h后即液化、腐爛； 3. 采收后的子實體容易開傘，營養(yǎng)價值下降，口感差， 商業(yè)價值低 4. 草菇生物轉(zhuǎn)化率低： 2030% 5. 常規(guī)的雜交育種培育抗寒的草菇菌株十分困難 ? 抗冷凍蛋白基因mRNA RTPCR afp gene pGafp ?mfc基因的克隆 實驗方案 表達(dá)載體 pvgafp 表達(dá)載體 pgVvsmfc PEG介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化 草菇菌絲原生質(zhì)體 PCR與 Southern雜交鑒定 含有 mfc基因的轉(zhuǎn)基因草菇 轉(zhuǎn)基因草菇后代遺傳穩(wěn)定性分析 擬轉(zhuǎn)化子的篩選 草菇對 0℃ 低溫致死時間的確定 多功能纖維素酶酶活測定 1p g V v s m f c4 7 8 5 b pm f cg p d V v s p r o m o t e rt e r m i n a t o rA m p +S a c IS a c I IB s r G IS p e IE c o R I?表達(dá)載體（ pgVvsmfc）的構(gòu)建 目的條帶 圖 2 PCR鑒定 圖 3 酶切鑒定 ACCCGCCAAAAAGCACAGAGGGCATGCGCTTGACTGAAGCGTCGACGAATCACTAGTGATTTATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAGTCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGAACAGGGAGTTTTATCTATTTTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATCCATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGGCTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGGCCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCCTTTCAAAGGCACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGGCGATAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTCGGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAAGGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAGATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTCCGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCCATTGACTGCTTGAATAATCGAATTCCCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA 圖 4 表達(dá)載體 pgVvsmfc 測序結(jié)果圖 1p V g a f p4 1 68 b pa f p g e neV g p d p r o m o t e rt e r m i n a t o rA m p +S a c IS a c I IN c o IS a l IB s r G IK p n I?表達(dá)載體 pvgafp ?草菇原生質(zhì)體的制備與再生 圖 5 草菇 V23原生質(zhì)體含 D甘露醇的 PDA培養(yǎng)基上再生 ?草菇原生質(zhì)體再生菌絲 0℃ 低溫致死時間的確定 致死時間
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