海洋酵母菌發(fā)酵產(chǎn)鐵載體的分析畢業(yè)論文(文件)
【正文】 。 Neilands amp。除了由接合菌生產(chǎn)的羧酸類(lèi)鐵載體，幾乎所有的真菌鐵載體都是異羥肟酸類(lèi)(van der Helm and Winkelmann 1994)。除了輔助攝取環(huán)境中的鐵，鐵載體在胞內(nèi)鐵的貯存當(dāng)中也起著一定作用。其代表性的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)如圖11所示：圖11真菌異羥肟酸類(lèi)鐵載體結(jié)構(gòu)Fig11 Structures of fugal hydroxamate siderophores大多數(shù)鐵載體包含三個(gè)羥基，這些羥基與肽鍵或酯鍵相連形成一個(gè)八面體復(fù)合體。萎蔫酸的前體，環(huán)狀萎蔫酸C（也叫梭原素），包含有三個(gè)順式N乙酰N羥基鳥(niǎo)氨酸（被稱(chēng)為單體順式萎蔫酸）。高鐵色素（ferrichrome）與鐵色素（Ferrichromes）相似。真菌鐵載體大多是源于L鳥(niǎo)氨酸的異羥肟酸鹽型（Plattner and Diekmann，1994），不像細(xì)菌那樣變化很大。這是大多數(shù)真菌鐵載體的基本結(jié)構(gòu)單位。對(duì)于鐵色素（ferrichromes）的合成，這些單位與氨基酸縮合形成環(huán)肽。這種方法主要用于兒茶酚類(lèi)鐵載體的檢測(cè)，其大體原理為：Fe3+兒茶酚類(lèi)鐵載體與兒茶酚類(lèi)鐵載體結(jié)合后呈紅色的顯色反應(yīng)，并且在510nm有最大光吸收值，根據(jù)此波長(zhǎng)下樣品的吸光度可對(duì)鐵載體進(jìn)行定量檢測(cè)和測(cè)定（Arnow，1937）。它的原理是：在有鐵載體存在時(shí)，由于鐵載體能夠與Fe3+形成更穩(wěn)定的螯合物，伴隨著Fe3+從其結(jié)合緊（消光系數(shù)至少100000）的藍(lán)色化合物轉(zhuǎn)移到鐵載體中而發(fā)生顏色變化，其顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬蜃仙Ｔ摲椒ㄊ菑臋z測(cè)羥胺的方法發(fā)展而來(lái)的（Csaky，1948）該方法中需要將樣品在硫酸中加熱，從而釋放出在酸性條件下穩(wěn)定的游離態(tài)羥胺，而其它可能干擾測(cè)定的含氮化合物在酸性條件下不穩(wěn)定。常用的方法有有限鐵生長(zhǎng)法（Ironlimitied culturing）和交叉培養(yǎng)法（Crossfeeding）限鐵生長(zhǎng)法就是通過(guò)在培養(yǎng)基中加入與鐵具有高親和力的化學(xué)螯合物（如EDDHA、雙吡啶）來(lái)獲得低鐵條件（Hiroaki et al.，2002；Hiroshi et al.，2000）。將待測(cè)菌的培養(yǎng)上清液、提純的鐵載體或細(xì)胞活體加入到已經(jīng)接種了指示菌的限鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)適當(dāng)培養(yǎng)后，觀察指示菌的生長(zhǎng)情況。因此應(yīng)在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。但是在?dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，口服紅酵母酸并沒(méi)用明顯效果。2不同培養(yǎng)基中海洋普魯蘭類(lèi)酵母（Aureobasidium pullulans） 海洋普魯蘭類(lèi)酵母（Aureobasidium pullulans）。為了衡量天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基之間哪個(gè)更有利于鐵載體產(chǎn)生，并以Csaky試驗(yàn)法測(cè)量鐵載體濃度。（敲除了SreA基因，其鐵載體產(chǎn)量受周?chē)h(huán)境中鐵濃度的影響減弱）1N H2SO4溶液醋酸鈉溶液（Sodiun zcetate）: 35g醋酸鈉晶體溶于100mL蒸餾水中對(duì)氨基苯磺酸(Sulfanilic acid):1g對(duì)氨基苯磺酸溶于100mL，30％（v/v）的乙酸中，加熱溶解。用蒸餾水將濾液定容至800ml。配制過(guò)程中所用的玻璃器皿都經(jīng)過(guò)6 N的HCl溶液浸泡過(guò)夜，用三蒸水沖洗，去除容器上附著的痕量鐵，以避免其對(duì)實(shí)驗(yàn)引起干擾將菌種接于YPD培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)48h。其它培養(yǎng)條件按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行。其中一組每瓶中加入500uL的 L鳥(niǎo)氨酸，另一組則不加。經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)并處理后，測(cè)量520nm處的吸光度值。由此可見(jiàn)L鳥(niǎo)氨酸對(duì)天然培養(yǎng)基效果不大。而在天然培養(yǎng)基中，菌體可利用的鐵較為充足，因此鐵載體的合成不旺盛，L鳥(niǎo)氨酸的影響也就相對(duì)較小。發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為200rpm。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，配制成1mg/mL蛋白溶液。另將 3g 砷酸氫二鈉（ Na2HAs04 . 7H20) 溶解于 25ml 蒸餾水中，然后加到鉬酸銨溶液中，室溫下放置于棕色瓶中可長(zhǎng)期備用。產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基（w/v）：%，(NH4)2SO4 %，K2HPO4 %，檸檬酸 %，MgSO4 %，ZnSO4 %，pH 。在28℃下，轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)120h，并每隔12h進(jìn)行一次取樣檢測(cè)。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每試管加入銅試劑 2m1, 混勻后沸水浴中加熱 10min ，立即冷卻，再加入 2m1 砷鉬酸試劑。沸水浴中加熱 10min后，再加入 2m1 砷鉬酸試劑。將活化的酵母菌接種于150 mL的產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中，在30℃和180 rpm下振蕩培養(yǎng)40h，即為種子液。在12000rpm下離心5min。測(cè)量細(xì)胞破碎后的懸濁液的胞內(nèi)蛋白濃度，并對(duì)懸濁液12000rpm下離心15min,測(cè)其鐵載體濃度。 SD, n=3.圖38發(fā)酵罐中最佳發(fā)酵條件下R6的胞外鐵載體濃度Fig38 Time course of the siderophore production out of cells by he yeast R6Data are given as means 177。圖39顯示胞內(nèi)鐵載體濃度總體呈上升趨勢(shì)，并且同樣在108h處有最大值。隨著菌體生長(zhǎng)，蔗糖被分解為還原性的葡萄糖和果糖，故還原糖濃度升高，隨著菌體數(shù)量的增加，碳源被逐漸消耗，所以發(fā)酵后期，還原糖濃度降低。 Emery, T. Stereochemical aspects of iron transport in Mycelia sterilia EP76. Journal of Bacteriology, 1988, 170:13771379.9 Adjimani, J. P. amp。 Diekmann, H. Stoffwechselprodukte von . Mitteilung. Biosynthese von sideraminen in pilzen. cis△2Anhydromevalons228。在此，我要首先感謝我的導(dǎo)師池振明教授。在此真心祝愿他們學(xué)業(yè)有成，工作順利！論文的順利完成同樣要感謝我的父母和親友，是他們一直在背后默默地支持我、關(guān)心我、鼓勵(lì)我，他們的支持和無(wú)私的奉獻(xiàn)是我學(xué)業(yè)順利完成的巨大動(dòng)力，衷心祝愿我的家人永遠(yuǎn)健康、幸福！最后還要衷心感謝在百忙之中評(píng)閱論文和參加答辯的各位專(zhuān)家、教授！。在此向池教授表示衷心的感謝和誠(chéng)摯的敬意，并祝愿老師身體健康、工作順利！論文的順利完成還要感謝本實(shí)驗(yàn)室池哲師兄、馬再超師兄、王光遠(yuǎn)師兄等實(shí)驗(yàn)室諸位老師和師兄師姐的的無(wú)私幫助。 ure: CoAligase. Archives of Microbiology, 1974, 95: 213225.15 Anke, H., Kinn, J., Bergquist,K. E.amp。 Leong, S. A. The se
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