免疫組化考試必備(文件)
【正文】 本原理：免疫金染色法（IGS法）： 直接法將膠體金標記的一抗直接對標本進行染色,然后在光鏡或電鏡下觀察 間接法先將未標記的特異性一抗與標本中的抗原結(jié)合，然后加金標二抗或SPA與一抗結(jié)合，在光鏡或電鏡下對抗原的分布進行定位研究。免疫組化染色對照的設計：目的在于排除假陽性或假陰性，正確評價免疫組化染色結(jié)果。陽性對照：是指用已經(jīng)證實含有靶抗原的組織切片與待檢標本同樣染色，結(jié)果應為陽性。抑制試驗：待檢標本先與未標記的特異性抗體反應后再與標記的特異性抗體染色，結(jié)果明顯減弱或轉(zhuǎn)陰性。導致非特異性染色的因素：靶組織或細胞（自發(fā)熒光、內(nèi)源性酶、生物素和色素） 標記物 抗體 靶組織與抗體的相互作用*特異性熒光：是指由抗原抗體反應形成的免疫復合物所帶熒光素在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)的特異性熒光。免疫組化出現(xiàn)假陰性原因：抗體：失活、濃度過低、 抗體與試劑盒不配 標本固定或修復方式不當（抗原丟失或遮蔽) 方法敏感度低 組織處理及實驗操作步驟不當 沖洗后切片殘留過多緩沖液 染色順序、孵育溫度時間、底物顯色不當怎樣判斷特異性染色結(jié)果（即特異性染色的表現(xiàn)，而非特異性染色不存在這些表現(xiàn)）：陽性產(chǎn)物明顯、細顆粒狀，背景清晰對比鮮明 陽性染色強度深淺不一、陰性細胞和陽性細胞交叉存在 陽性產(chǎn)物定位明確－胞內(nèi)（膜、漿、核）、胞外 陽性細胞的分布狀態(tài)：定性、定量等。復性(renaturation)：又稱退火，是指變性的兩條DNA單鏈在合適的條件下，又可按原來堿基互補配對，再結(jié)合在一起形成雙螺旋結(jié)構的過程。原位雜交的基本原理：利用標記的核酸探針與組織細胞中的待測核酸進行雜交，然后用放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行檢測，從而在組織細胞原位顯示某種特定基因或mRNA分子。影響PCR的因素：模板核酸 引物 緩沖液 Mg2+ 三磷酸脫氧核苷酸(dNTP) 耐熱DNA聚合酶 溫度循環(huán)參數(shù)：包括變性溫度與時間、復性溫度與時間、延伸溫度與時間以及循環(huán)數(shù) 其它因素PCR過程中如何防止污染的發(fā)生：PCR反應前操作的地方和器材與反應后的應分開 所用的試劑應分成若干份保存，避免長期重復使用造成試劑污染 加樣時DNA樣品應最后加，并立即將管口蓋妥，避免空氣污染。*原位反轉(zhuǎn)錄PCR：是以mRNA為起始物，通過反轉(zhuǎn)錄合成靶序列的cDNA，然后以cDNA為模板施行聚合酶鏈反應擴增，以檢測細胞和組織內(nèi)mRNA靶序列。原位PCR過程中用到的技術有：組織學技術 PCR擴增技術 原位雜交技術 免疫組化技術 分子生物學技術原位PCR的四個基本步驟：樣本固定：目的是使整個循環(huán)過程中保持形態(tài)的完整 滲透：目的是為了讓擴增試劑更多的進入到細胞內(nèi)接近靶核酸 原位基因擴增：可通過特異的引物和熱穩(wěn)定DNA聚合酶增加靶核酸的拷貝數(shù)達檢出水平 擴增產(chǎn)物的檢測（可視化）*直接法原位PCR（Direct in situ PCR）：應用的引物和三磷酸核苷酸分別標以放射性同位素(如35S等)，非放射性同位素（如生物素和地高辛）進行PCR原位擴增，擴增的產(chǎn)物經(jīng)放射自顯影，免疫組化和親和組織化學方法進行檢測，不需原位雜交檢測特異性擴增產(chǎn)物的一種檢測技術。組織樣品制備時的注意事項：去除或抑制RNA酶：包括物理和化學方法 取材及固定：要求組織新鮮，取材過程中防止RNA酶的污染；為避免組織細胞中核酸的降解，保存組織細胞形態(tài)結(jié)構的完整性，可采用4%多聚甲醛等灌流或浸泡固定 包埋和切片：操作過程中要防止RNA酶污染，要求戴手套操作、切片刀用DEPC水擦拭，鑷子消毒后使用 玻片的處理：玻片上涂上粘附劑，防脫處理后高溫消毒原位雜交中可能會出現(xiàn)哪些問題，應怎樣避免這些問題：原位雜交實驗失?。禾结槪褐饕紤]探針的敏感性、探針的濃度、探針長度及保存的好壞等 組織材料的保存 實驗過程中防止RNA酶的污染，做到嚴格的無RNA酶操作 雜交前處理：包括蛋白酶消化的濃度、時間等 雜交的條件：時間、溫度等 雜交體的檢測 脫片：玻片進行防脫處理 注意雜交前預處理時蛋白酶的濃度和消化時間 防止雜交后漂洗過度 非特異性染色：探針的特異性不高 組織細胞內(nèi)內(nèi)源性酶染色：%~5%H2O2和1mmol/L左旋咪唑分別處理以避免組織內(nèi)源性過氧化物酶和堿性磷酸酶的干擾 注意雜交后的漂洗：要用濃度遞減的SSC溶液在一定溫度和振蕩下漂洗切片：2X SSC→1X SSC→ SSC 37℃。探針(probe)：即一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段。它以帶標記物的核酸作為探針，在一定條件下，在組織細胞原位與待測核酸序列（如DNA，RNA）進行雜交形成雜交體，然后通過與標記物相應的檢測系統(tǒng)，從而在原位對組織細胞中待測的核酸序列進行定性、定位和相對定量的研究。*自發(fā)熒光：是指組織不經(jīng)熒光素染色，在紫外光或短光波照射下所呈現(xiàn)的熒光，多為藍綠色或藍白色。免疫組化染色對照設計注意點：每次試驗同時做陽性對照和陰性對照 陰性對照應同時做空白對照和替代對照 間接法第一抗體陰性對照結(jié)果陽性時，應考慮第二抗體或橋抗體的替代對照?？瞻讓φ眨河昧姿峋彌_液(PBS)替代第一抗體（特異性抗體），其出現(xiàn)假陽性原因有：自發(fā)熒光、色素及內(nèi)源性酶的干擾；第二抗體或橋抗體的吸附導致假陽性。陰性對照：是指用確知不存在相應靶抗原的組織標本染色，結(jié)果應為陰性。免疫膠體金染色方法的特點：膠體金制備簡便 標記簡單 特異性強 敏感性高 定位準確 6. 適應性廣 易于雙重和多重標記。膠體金標記前的準備工作：包括膠體金探針的制備以及膠體金蛋白質(zhì)最佳結(jié)合率的測定。在適當條件下，還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒，形成金溶膠。卵白素與內(nèi)源性生物素已結(jié)合，從而阻斷了內(nèi)源性生物素的活性，再加入生物素與前面的卵白素結(jié)合封閉其所有的結(jié)合點，由于組織中所有的生物素已和卵白素結(jié)合，因此不能再與ABC中的卵白素發(fā)生反應。ABC法(AvidinBiotinperoxidase plex method)：是指將卵白素和生物素偶聯(lián)的過氧化物酶或堿性磷酸酶按一定比例組成卵白素生物素酶復合物(ABC復合物)，卵白素作為橋梁，與生物素標記抗體和生物素酶復合物連接，從而形成一種較大類似晶格的復合體，大大提高了免疫酶染色的靈敏度。親和細胞化學：利用兩種物質(zhì)間的高度親和特性及其可標記性，將酶等標記物連接到親和物上，以對體內(nèi)待檢物進行檢測的方法。熒光效率：是指吸收光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獾陌俜謹?shù)，即發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強度）/吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）X 100%。熒光：是指一個分子或原子吸收并儲存給予的能量后進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量以熒光形式釋放出來?？乖迯偷姆椒ǎ好赶? 微波輻射法 酸水解法 高壓加熱法 去垢劑處理法石蠟切片中抗原降低的主要原因：甲醛固定液中醛基與抗
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