dna與rna提取方法及原理與提取方法及原理dna提取專題dna提取專題第一部分(文件)
【正文】 并去除雜質(zhì) 沉淀或吸附核酸 材料準備基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 最好使用新鮮材料， 最好使用新鮮材料，低溫保 存的樣品材料不要反復凍融 提取血液基因組DNA時，要 時 提取血液基因組 選擇有核細胞（白細胞） 選擇有核細胞（白細胞） 組培細胞培養(yǎng)時間不能過長， 組培細胞培養(yǎng)時間不能過長， 否則會造成DNA降解 否則會造成 降解 含病毒的液體材料DNA含量較 含病毒的液體材料DNA含量較 DNA 少，提取前先富集 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 使用處于對數(shù)期的新鮮菌體 老化菌體導致開環(huán)質(zhì)粒增加） （老化菌體導致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時應加入篩選壓力， 培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則 菌體易污染， 菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒， 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為 低拷貝或大質(zhì)粒， 低拷貝或大質(zhì)粒，則應加大菌 體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細胞裂解基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 材料應適量，過多會影響裂解， 材料應適量，過多會影響裂解， 導致DNA量少，純度低 量少， 導致 量少 針對不同材料， 針對不同材料，選擇適當?shù)牧?解預處理方式： 解預處理方式： 植物材料－－ －－液氮研磨 植物材料－－液氮研磨 動物組織－－ －－勻漿或液氮研磨 動物組織－－勻漿或液氮研磨 組培細胞－－蛋白酶K －－蛋白酶 組培細胞－－蛋白酶 細菌－－ －－溶菌酶破壁 細菌－－溶菌酶破壁 酵母－－ －－破壁酶或玻璃珠 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時， 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 菌體量適當 培養(yǎng)基去除干凈， 培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌 體在懸浮液中充分懸浮 變性的時間不要過長（ 分鐘 分鐘）， 變性的時間不要過長（5分鐘）， 否則質(zhì)粒易被打斷 復性時間也不宜過長， 復性時間也不宜過長，否則會 有基因組DNA的污染 有基因組 的污染 G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應先 酵母質(zhì)粒的提取， 用酶法或機械法處理， 用酶法或機械法處理，以破壁 ? ? ? ? ? 核酸分離、 核酸分離、純化基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提 時 采用吸附材料吸附的方式分離 供相應的緩沖體系 采用有機（ 氯仿 抽提時應充分混勻， 氯仿） 采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但 動作要輕柔 離心分離兩相時， 離心分離兩相時，應保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點， 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相 應的去雜質(zhì)的方法 核酸分離、 核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除： 蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌 蛋白酶處理 核酸分離、 核酸分離、純化多糖的去除： 多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體 1/2 積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積) 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可 (1/2體積 以與多糖的羥基作用， 以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 樣品不純， PCR反應 問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。 問題三：DNA提取量少。 增加吸附的時間， 增加吸附的時間，或低溫沉 淀 小心操作 RNA提取專題 RNA提取專題第一部分： 第一部分：RNA提取方法簡介 提取方法簡介 第二部分：RNA提取及常見問題分析 第二部分： 提取及常見問題分析 分離提純RNA的目的 分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況 獲得新基因 研究基因的拼接 分析相應的蛋白產(chǎn)物 RNA的不穩(wěn)定性 RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和 位置帶有羥基 位置帶有羥基， 由于核糖殘基的 和3’位置帶有羥基，RNA易 易 于被RNA酶切割水解 于被 酶切割水解 RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復 酶含量豐富， 酶含量豐富 活性， 活性，不易失活 提取RNA的注意事項 提取RNA的注意事項經(jīng)常更換新手套。 污染 使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。 的塑料和玻璃器皿 150℃烘烤4小時，塑料器皿可在 ℃烘烤 小時 NaOH中浸泡 小時， 中浸泡10 中浸泡 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對 酶失活。 酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制 酶的活性。 酶結合，使其失活。使細胞及核蛋白復 月桂肌氨酸 合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸 合物變性，釋放 ， 酶。 或用異丙醇沉淀濃縮 。 織選取雜質(zhì)少的部位 細菌和酵母需要勻漿處理。 底而迅速地勻漿。 樣品儲存液中保存。 現(xiàn)取現(xiàn)提。 使DNA及蛋白沉淀到有機相。 其它：SDS、尿素、硅藻土等對 、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 酶
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