《生物制品的制備》ppt課件(文件)
【正文】 防護等有關(guān)。在 。 上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建 下游技術(shù)：目的基因產(chǎn)物的分離純化 一、上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建 目的基因的分離制備與鑒定 重組載體的選擇與制備 目的基因與載體的重組 構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細胞（表達載體） 篩選含有重組子的細胞進行擴增 目的基因的分離制備與鑒定 （ 1）目的基因所處染色體的確定 （ 2）目的基因的獲取 目的基因可以是染色體 DNA、 cDNA或人工合成的 DNA，目的基因不同，獲取方法也不同。以目的基因的 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補 DNA（ cDAN）。世界上第一個人工化學(xué)合成并表達的基因是生長素釋放抑制素基因。質(zhì)粒 DNA分子可以游離存在于染色體外，在一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂遺傳給后代。 pBR322 Apr PstⅠ BamHⅠ SalⅠ 用限制性內(nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入選定的載體中。 構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細胞（表達載體） 將目的基因插入 pBR322的氨芐青霉素（ Ap）抗性基因中（導(dǎo)致該基因失活）然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌，再將此細菌涂布在含四環(huán)素（ Tc）的選擇平板上培養(yǎng)，由于轉(zhuǎn)化的細菌獲得了 Tc抗性而可以在此平板上生長，未轉(zhuǎn)化的則被殺死。其中的分離純化技術(shù)是極其重要的一環(huán)，有時又將生物制品的這一環(huán)節(jié)稱為后處理，它包括破菌、固液分離、濃縮、純化直至得到純品。 也應(yīng)凍干低溫保存。 。 工作代工程菌種： 自主代工程菌種經(jīng)傳代擴種獲得，又稱 工作代種子批 ， 也應(yīng)凍干低溫保存，其生物學(xué)特性及工程菌特性應(yīng)與主代、 原始代工程菌種一致。 同時取樣作各類檢定工作，并用于建立主代 種子批 。 篩選含有重組子的細胞進行擴增 轉(zhuǎn)染成功的細菌在含有Tc的培養(yǎng)基中生長 Tc 用無菌牙簽將單菌落轉(zhuǎn)移至含Tc和 Ap的培養(yǎng)基上 Ap Tc 37℃ 過夜 回收重組和轉(zhuǎn)染成功的菌落并進一步擴增 Ap Tc pBR322 目的基因 DNA連接酶 重組子 宿主細胞（大腸桿菌） 轉(zhuǎn)染宿主細胞 限制性核酸內(nèi)切酶 篩選、擴增 工程菌 下游技術(shù) 對于下游工作，并無明確的定義。 目的基因與載體的重組 原核表達系統(tǒng)： 大腸桿菌 、 枯草芽孢桿菌、鏈霉菌 。 重組載體的選擇與制備 pBR322質(zhì)粒來源： pSF2124質(zhì)粒的氨卞青霉素抗性基因（ Apr）； pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（ Tcr）；ColEⅠ 的派生質(zhì)粒的復(fù)制起點（ ori）。 凝膠電泳及酶切圖譜測定 核酸雜交 DNA序列測定 （ 3）目的基因的鑒定 常用的載體有： 細菌質(zhì)粒 質(zhì)粒是一些細菌的亞細胞結(jié)構(gòu)，是存在于多種細菌染色體外的遺傳單位?；瘜W(xué)合成的先決條件是必須要知道 DNA的堿基順序。獲取的基因是染色體 DNA。 新鮮豬血 去血漿，離心 紅細胞 %NaCl,反復(fù)洗滌 3次 收集 工藝路線 浮洗 凈紅細胞 溶血 血去離子水， 5℃ ,30min 溶血物 去血紅蛋白 乙醇，氯仿 ,15min 上清液 沉淀 丙酮， 0℃ 沉淀物 去離子水 5565℃ ， 1015min 黃綠色澄清液 沉去不溶蛋白，透析 丙酮，去離子水， 0℃ ， 68h 透析液 吸附、吸脫、超濾、濃縮、干燥 DEAESephadexA50,磷酸緩沖液（ K3PO4）， SOD成品 第四節(jié) 基因工程生物制品的制備 先確定與某種疾病有關(guān)的具有預(yù)防或治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成的基因分離或進行人工合成，利用重組 DNA技術(shù)將該基因加以改造，再將改造后的基因?qū)肟梢圆粩喾敝车氖荏w細胞，從而大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)。 ?SOD存在于動物、植物、微生物中，有 CuZnSOD、 MnSOD、 FeSOD等。 （ 2） 對其他原料的利用 ， 胎盤是重要的人類原料之一 ， 較好利用的只有胎盤球蛋白、 胎盤白蛋白等少數(shù)品種 。 血（無抗凝劑） → 自然凝固 → 分離出血清（無纖維蛋白酶原、凝血因子等） 血 +混合抗凝劑 草酸銨 草酸鉀 離 心 上清血漿 總蛋白： % 白蛋白： % 水： 9092% （現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉） （ 2）工藝路線 利凡諾 ,NaHCO3 ,離心分離 絡(luò)合物 蒸餾水， NaCl， HCl 弱酸性， 40℃ ，離心 離心液 濃 縮 超 濾 濃縮液 滅活病毒 65℃ ， 1h； 60℃ ， 10h 熱處理液 除菌 除菌過濾 白蛋白液 干燥 冷凍干燥 白蛋白 去雜蛋白 人血漿（ %） 男性尿 沉淀 10℃ 下， 上清尿液 酸 化 酸化尿 吸 附 硅藻土， 5℃ 硅藻土吸附物 洗滌 5℃ ，水 硅藻土柱 洗脫 %氨水， 洗脫液 去熱源、色素 DEAESephadexA50柱， , （二乙氨乙基葡聚糖） 流出液 （活性部分 ） 濃 縮 羧甲基纖維素（ CMC柱， ) CMC柱 洗脫（ HACNaAC) NH3+NaCl, 洗脫液 透
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1