db21t 18612-20xx 水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(文件)
【正文】 30s。L提取的DNA，用濃度1~2％瓊脂糖凝膠100V電泳 30 min，檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。 紫外吸收定量測(cè)試260nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值，根據(jù)公式計(jì)算DNA濃度。L備用。L， 37℃保溫3h， 65℃保溫3h。l5U乙酰化牛血清白蛋白10181。l——10181。表2 接頭連接反應(yīng)體系試劑體積（181。L)Acetylated BSA超純水總計(jì)預(yù)擴(kuò)增引物序列見附錄B。l)MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物 (50ng/181。L)EcoRⅠ選擇擴(kuò)增引物 (50ng/181。（2）6％變性聚丙烯酰胺凝膠制備：按表7配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠。（5）產(chǎn)物變性 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中添加等體積上樣緩沖液混勻，95℃變性5min，迅速置于冰上。（8）銀染 取下凝膠板，拆除耳板和邊條，將其置于10％冰醋酸中進(jìn)行固定，搖床上搖30min，將膠板轉(zhuǎn)入超純水中清洗3次，每次2min，將膠板置于銀染液中染30min，超純水沖洗5s后立即放入顯影液中，待條帶顯出后，用10％冰醋酸定影5min，自來水沖洗1min，晾干。建立各個(gè)群體的01數(shù)據(jù)陣列。 CTCGTAGACTGCGTACC3180。 GACGATGAGTCCTGAG3180。GACTGCGTACCAATTC 3180。GACTGCGTACCAATTCXXX3180。_________________________________。GATGAGTCCTGAGTAAXXX3180。GATGAGTCCTGAGTAA 3180。TACTCAGGACTCAT5180。CTGACGCATGGTTAA5180。并用 UPGMA做基于Nei’s遺傳距離的樹形圖，以及用鄰近法（Neighbor joining method，NJ）構(gòu)建聚類圖（系統(tǒng)樹檢驗(yàn)置信度值為1000次）。9 數(shù)據(jù)分析選擇電泳后清晰的擴(kuò)增片段進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。L。表7 6%聚丙烯酰胺變性凝膠配制藥品與試劑體積20％膠儲(chǔ)存液15mL超純水10％過硫酸銨TEMED總體積50mL（3）預(yù)電泳 凝膠聚合后，將梳子正向插入膠頂空處，形成加樣孔，連接好電泳設(shè)備，添加TBE電泳緩沖液。l)dNTPs (5mM)10X PCR緩沖液2Taq聚合酶 (5U/181。l)MgCl2 (25mM)超純水接頭連接液總計(jì)表4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃（初始變性）2 min94℃（變性）1 min26 個(gè)循環(huán)56℃（退火）1 min.72℃（延伸）1 min.72℃（終了延伸）5 min.選擇擴(kuò)增引物序列見附錄C，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10100倍作為選擴(kuò)增模板，按表5配制選擴(kuò)增體系，按表6進(jìn)行PCR反應(yīng)。表3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑體積(181。L)MseⅠ 接頭(2PM/181。l
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