【正文】 蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的一項(xiàng)必需的和基礎(chǔ)的工作。 ▲ 目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化程序主要包括 : ⑴ 材料的選擇； ⑵組織勻漿和破碎細(xì)胞獲取粗提取液；⑶蛋白質(zhì)初步提純；⑷選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白 ,直至完全純化；⑸目標(biāo)蛋白的鑒定。 作為兩性電解質(zhì)，每種蛋白質(zhì)都有其等電點(diǎn) (pI) ，這與它所含的氨基酸種類和數(shù)量有關(guān)。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進(jìn)行非變性電泳和變性電泳。 ● 等電聚焦 是在聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，它與 SDSPAGE結(jié)合構(gòu)成的雙向電泳技術(shù)可用于確定蛋白質(zhì)的亞基組成及電荷異構(gòu)體的分析 （圖 245） 。 ◎ 免疫印跡 (Immunoblotting)或蛋白質(zhì)印跡 (Western blotting)是檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的一項(xiàng)十分有效的方法。蛋白質(zhì)樣品同離子交換纖維素的結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團(tuán)的靜電吸引，這與溶液的 pH有關(guān)，因 pH決定離子交換劑與蛋白質(zhì)的解離程度。 弱酸性的陽(yáng)離子交換劑一般適合于分離 pI＞ 。 鹽溶現(xiàn)象： 在鹽溶液很稀的范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加，球狀蛋白質(zhì)的溶解度也隨之增加 （ 圖 248） ，此現(xiàn)象稱作 鹽溶 (saltingin) 。 離子強(qiáng)度 (μ) ＝ ΣCZn21/2 三、 蛋白質(zhì)的沉降作用及超離心分離 沉降速度 (ν = dx / dt )與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)。 四. 凝膠過(guò)濾 是指利用高度水化的，具有不同大小孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的惰性多聚物顆粒作為層析柱的填充物，把分子大小不同的蛋白質(zhì)混合物上樣到柱層析上，混合物中的各組分隨著洗脫液的流動(dòng)，按分子大小以不同的速度向下移動(dòng)，從而把各組分分開(kāi) （圖 249） 。B 假若用化學(xué)的方法先將 B物質(zhì)與一種不溶性載體 (R) 偶聯(lián)，得到 RB，偶聯(lián)到 R上的 B不喪失與 A結(jié)合的能力的話，那麼，將含有 A的混合蛋白通過(guò)裝有 RB的層析柱時(shí)， A將與 B結(jié)合 , 形成 R－ B酶的催化活性受多種因素調(diào)節(jié)控制。 很顯然 , 轉(zhuǎn)換態(tài)越能有效的達(dá)到，反應(yīng)的速度就越大。 因此，在有催化劑存在的情況下，轉(zhuǎn)換態(tài)能比較有效地達(dá)到，從而增高反應(yīng)的速度。酶的存在，象其他催化劑一樣，只能降低達(dá)到轉(zhuǎn)換態(tài)所需的活化能而不能改變反應(yīng)的平衡，它唯一的作用是加速反應(yīng)物和產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)化。 某一種酶往往只能對(duì)某一類物質(zhì)起作用，或者只對(duì)某一種物質(zhì)起催化作用。 prosthetic group)， 它們是這類酶的催化活性的必要條件，缺少它們，酶的催化作用就會(huì)消失。 六、某些 RNA具有催化活性 長(zhǎng)期以來(lái) ,人們都認(rèn)為所有的酶都是蛋白質(zhì) .但是近 20年來(lái)，越來(lái)越多的例子表明某些 RNA分子也是生物催化劑。另外一個(gè)例子是 四膜蟲 26S rRNA前體中的插入順序的切除與兩端片段的正確拼接不需要蛋白質(zhì)的催化，是一種自我剪接的過(guò)程。當(dāng)把所有的蛋白質(zhì)組分從 50S核糖體亞基中去除后， 23S rRNA能催化這一肽鍵的形成反應(yīng) (圖 3— 2). 七、催化抗體 抗體酶 抗體是免疫球蛋白。因此 , 一種催化抗體便能促使它的底物形成轉(zhuǎn)換態(tài)構(gòu)象，從而加速這一反應(yīng)。 3).如果所催化的反應(yīng)包含二種變化，則盡可能用同一種變化 來(lái)表示 ,另一個(gè)功能附后。 可分為 需氧脫氫酶、氧化酶 和 不需氧脫氫酶 。B + ADP + Pi(或 AMP + PPi) 例如谷氨酰胺合成酶催化的反應(yīng)： （圖 33） Section 3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 一、酶活力與酶的反應(yīng)速度 要檢查酶的存在及含量 , 不能直接用重量或體積來(lái)表示 , 要根據(jù)酶引起的某一特定的化學(xué)反應(yīng)的能力來(lái)表示 , 即用酶的活力來(lái)表示 . 酶活力的高低是研究酶的特性、進(jìn)行酶制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用時(shí)的一項(xiàng)不可缺少的指標(biāo) .酶活力又叫酶活性 (activity)是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力 . 酶反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量表示 , 即用 : d[s]/d[t] 或 d[p]/d[t] 表示 . 研究酶反應(yīng)速度或測(cè)定酶的活性應(yīng)以酶促反應(yīng)的初速度(initial rate)為準(zhǔn) .初速度是指在酶濃度底物濃度一定的條件下 , 在最初一段時(shí)間內(nèi) , 產(chǎn)物的濃度隨時(shí)間的增加而成比例的增加時(shí)的速度 （圖 36） 。 此外 , 在酶的純化工作中還要計(jì)算兩個(gè)具有實(shí)際意義的項(xiàng)目 , 即 純化倍數(shù)和回收率 (產(chǎn)量 %)： 純化倍數(shù) = 每次比活力 /第一次比活力 回收率 （產(chǎn)量 %） =(每次的總活力 /第一次總活力 ) 100 二 、酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué) 酶動(dòng)力學(xué)研究的是酶催化反應(yīng)的速度，描述酶作為催化劑的生物學(xué)作用 , 描述酶是怎樣完成它們所催化的反應(yīng)。 1) 中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō) 酶動(dòng)力學(xué)研究始于 1902年，當(dāng)時(shí)， β 呋喃果糖糖苷酶對(duì)蔗糖進(jìn)行水解。一般以產(chǎn)物的生成速度代表整個(gè)酶催化反應(yīng)速度，而產(chǎn)物的生成取決于中間物的濃度 . 因此 , 整個(gè)酶促反應(yīng)的速度取決于中間物的。因此，他提出，蔗糖水解的總反應(yīng)是由兩個(gè)基本反應(yīng)構(gòu)成， 第一步是底物與酶形成一種復(fù)合物，第二步是這種中間物生成產(chǎn)物并釋放出酶 : k1 k2 E + S ←→ ES → P + E k1 這里 ,E、 S、 ES和 P分別代表酶、底、酶 底物復(fù)合物和產(chǎn)物。這就是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基本內(nèi)容。 酶的比活力 (specific activity) 比活力 是指每 mg蛋白質(zhì)所具有的活力單位數(shù) , 即 活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì) . 在酶的純化過(guò)程中 , 每步純化后都要測(cè)定酶的比活力 , 比活力高 , 表明酶的純度高。B ←→ A + B 例如： （圖 34） (isomerases)：催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變： A ←→ B 如異構(gòu)酶和消旋酶催化的反應(yīng)。 二 .酶的分類 (圖 33) : 催化氧化還原反應(yīng)： A Section 2. 酶的命名與分類 一 . 命名原則 例如：乙醇脫氫酶 1).應(yīng)標(biāo)明酶的所有底物及催化的性質(zhì)，并用 : 符號(hào)把底物分開(kāi)。象其它抗體一樣 , 抗體酶也是一種生物對(duì)叫做抗原 (antigen)的某種外源分子作出應(yīng)答的產(chǎn)物 , 只是這種抗原分子被有目的地改造成某種反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)中間物。 ,肽鍵的形成很可能是 50S核糖體亞基催化的。 例如 ,RNase P是一種與 tRNA前體加工成 tRNA反應(yīng)有關(guān)的酶。 酶的 活性中心可分兩部分： 參與和底物結(jié)合的 結(jié)合部位 (binding site) 及直接參與催化反應(yīng)的 催化部位 (catalytic site) 。 五 、 酶的組成 1．酶的組成 ● 由單純蛋白質(zhì)所構(gòu)成的酶 ● 由蛋白質(zhì)和其他成分構(gòu)成的酶 :除了蛋白質(zhì)成分 (即 酶蛋白apoenzyme)外，還含有一些對(duì)熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)小分子物質(zhì) (即 輔助因子 cofactor)。 反應(yīng)的平衡與△ G0′ （產(chǎn)物與反應(yīng)物所固有的標(biāo)準(zhǔn)自由能之差）有著密切的關(guān)系，但反應(yīng)速度則與△ G?有關(guān)。 三、酶不能改變化學(xué)反應(yīng)的平衡 反應(yīng)速度和反應(yīng)平衡之間有著重要的差別。 毫無(wú)例外 , 每一種化學(xué)反應(yīng)都有一個(gè) △ G?。 反應(yīng)的發(fā)生 ,即產(chǎn)物的生成取決于過(guò)渡態(tài)或轉(zhuǎn)換態(tài) (transition state)的能量狀況 。 練習(xí)題 1. 某種蛋白質(zhì)當(dāng)用凝膠過(guò)濾法測(cè)定其分子量為 90kD，而用SDSPAGE測(cè)定其分子量為 60kD，無(wú)論是否有巰基乙醇存在都如此。 五、蛋白質(zhì)的配體特異性與親和層析 根據(jù)蛋白質(zhì)的配體特異性，建立了一種非常有效的蛋白質(zhì)分離方法 ——親和層析法 。 沉降平衡法 ，適用于沉降系數(shù)相近，但密度不同的蛋白質(zhì)。任何降低溶質(zhì)分子相互作用的因素以及加強(qiáng)溶質(zhì)分子與溶劑分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。 二 、 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與鹽析分離 蛋白質(zhì)在水中可形成一種穩(wěn)定的親水膠體 。故蛋白質(zhì)混合物的洗脫分離可由改變洗脫液中的鹽類的離子強(qiáng)度和 pH來(lái)完成。在電泳之后 ,欲檢測(cè)目標(biāo)蛋白的存在 ,可以先將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 ,然后用目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的抗體與之產(chǎn)生抗原 抗體反應(yīng) ,最后可用連接有堿性磷酸酯酶或辣根過(guò)氧化酶的第二抗體 (通用抗體 )與第一抗體反應(yīng) ,加入能與抗體共接的酶反應(yīng)生成有色物質(zhì)的生色液 ,即可十分可靠地檢到的目標(biāo)蛋白 (圖 246)。對(duì)于一個(gè)混合蛋白質(zhì)的電泳分離來(lái)說(shuō) ,它只能檢測(cè)樣品的分離情況；如果被檢蛋白質(zhì)的位置可以確定 ,可以將該蛋白質(zhì)的色帶切下之后進(jìn)行脫色 ,測(cè)定脫色液光吸收值 ,能對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。 ● 變性電泳： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDSPAGE)， SDS是一種帶負(fù)電荷的陰離子去垢劑，分子式： CH3(CH2)10CH2OSO3－ Na＋ ， 它能使蛋白質(zhì)變性、肽鏈伸展，并吸附在伸展的肽鏈上，吸附的量與鏈長(zhǎng)成比例。 1. 蛋白質(zhì)的電泳分離 凝膠電泳是目前常用的一種生化方法。因此，在目標(biāo)蛋白質(zhì)的整個(gè)分離純化過(guò)程中要在較低溫度下 (0－ 4℃) 操作，注意使用蛋白酶 (使蛋白質(zhì)降解的酶 )的抑制劑，避免使用劇烈條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊結(jié)構(gòu)受到破壞。目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離決不是一件輕而易舉的事情，因?yàn)橐阉c性質(zhì)、大小和結(jié)構(gòu)十分相似的其他蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)存在許多困難。血紅蛋白與 氧 結(jié)合時(shí)的協(xié)同效應(yīng)是別構(gòu)作用的結(jié)果 。因此，很可能當(dāng)一個(gè)亞基的氧結(jié)合部位同氧結(jié)合后就影響其他亞基對(duì)氧結(jié)合的親和力。 S形的 結(jié)合曲線是一種蛋白質(zhì)的小分子結(jié)合部位之間協(xié)同作用的標(biāo)志。 α亞基由 141個(gè) 氨基酸 殘基組成， β亞基由 146個(gè) 氨基酸 殘基組成。血紅素是含鐵的原卟啉。 氧的飽和百分?jǐn)?shù)： Y= [HbO2／（ HbO2 + Hb） ] 100％ 分壓： 混合氣體中，各氣體單獨(dú)在同樣的溫度下占據(jù)混合氣體的體積時(shí)所具有的壓力。 Section 5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一、 血紅蛋白與肌紅蛋白的功能比較 血紅蛋白 是血液中紅細(xì)胞的主要蛋白質(zhì)。 局部折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu) —→ 熔融小球 —→ 三級(jí)結(jié)構(gòu)形成開(kāi)始 —→具域結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)形成 （圖 236） 。 ： Anfinsen證明，變性的核糖核酸酶 A（ RNase A）只有處在天然構(gòu)象穩(wěn)定的條件下才能重新形成它的正確的二硫鍵，并恢復(fù)酶的活性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)加熱變性時(shí)，其構(gòu)象上的敏感特征如比旋度、粘度和紫外吸收等在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)急劇變化。 例如，細(xì)菌谷氨酰胺合成酶的活性部位就是由相鄰亞基對(duì)構(gòu)成的，解離的單體是無(wú)活性的。 ? 協(xié)同性 . 這是寡聚體蛋白 (包括寡聚體酶 )的一個(gè)重要的性質(zhì)。 ? 遺傳上的經(jīng)濟(jì)性和有效性 . 蛋白質(zhì)單體的寡聚結(jié)合對(duì)一種生物來(lái)說(shuō)，在遺傳上是經(jīng)濟(jì)的。 因此，蛋白質(zhì)只有旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 (rotational symmetry)這樣一種類型的對(duì)稱方式 （圖 234） 。在血紅蛋白中，一個(gè) α 亞基和一個(gè) β 亞基組合成一個(gè)原體。 由于寡聚蛋白質(zhì)是由多個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基有其本身的折疊結(jié)構(gòu) (三級(jí)結(jié)構(gòu) )，所以 研究寡聚蛋白質(zhì)中亞基的數(shù)目和亞基間的相互關(guān)系 (即它們的空間位置 )就構(gòu)成了寡聚蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)容。 這種力是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。 ▲ 偶極與偶極間的相互作用 : 在電中性分子之間的非共價(jià)結(jié)合統(tǒng)稱為范德華力。 2. 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象穩(wěn)定的因素 蛋白質(zhì)多肽鏈在生理?xiàng)l件下折疊形成特定的空間構(gòu)象顯然是熱力學(xué)上一種有利的過(guò)程，是各種作用力相互作用、精巧平衡的結(jié)果 。 4). 結(jié)構(gòu)域 (domain) 分子較大的多肽鏈常折疊成兩個(gè)或多個(gè)球狀簇，這種球狀簇叫做域或結(jié)構(gòu)域。這些組合有： ● β α β 基元： 兩個(gè)平行的 β 鏈由一個(gè) α 螺旋右手交聯(lián) ,為最常見(jiàn)的一種組合 （圖 229） 。 三、球狀蛋白質(zhì)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 球狀蛋白質(zhì)近似球形。在許多蛋白質(zhì)中都可觀察到一種 稱作 β 轉(zhuǎn)角 (β turn orβ –bend) 的結(jié)構(gòu)，它是由 4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成 （圖 227） 。在絲心蛋白的長(zhǎng)軸方向上具有 ，所以絲心蛋白的空間結(jié)構(gòu)是 β 析疊式的。 由于在每種折疊形式中 , 每對(duì)扭角都是分別相等的 , 故這兩種結(jié)構(gòu)都是有規(guī)律的主鏈構(gòu)象 。 氫鍵是在多肽鏈中第 n個(gè)殘基的羰基氧與螺旋方向的第 n ＋ 4個(gè)殘基的酰胺氫之間形成的（圖 222） 。 ,ψ ＝ 47176。 當(dāng)多肽鏈處在完全伸展?fàn)顟B(tài)時(shí)，