【正文】 Ⅱ ：本項(xiàng)目已初步建立的成體干細(xì)胞向腎組織細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化體系。 Ⅰ . 已發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾對(duì)胰 /腎祖細(xì)胞分化過(guò) 程的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制 本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)最新發(fā)現(xiàn)作用于 H3K27me3 去甲基化酶 UTX 與異染色質(zhì)蛋白HP1 相互作用（圖 10a）。本項(xiàng)目將圍繞組蛋白修飾在胰 /腎祖細(xì)胞分化過(guò)程中這一相互作用發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)展開(kāi)深入研究。 C. 干細(xì)胞體內(nèi)功能分析評(píng)價(jià)技術(shù)的可行性分析 分析評(píng)價(jià)干細(xì)胞移植治療糖尿病后在受體內(nèi)的生物學(xué)功能，必須結(jié)合干細(xì)胞的標(biāo)記和示蹤。同時(shí)利用分子影像技術(shù)（ PET、 MRI、 CT）等監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植后器官的功能（ PLoS ONE, 2020。 圖 11： Fluc和 GFP融合基因標(biāo)記人 hES細(xì)胞后可進(jìn)行體內(nèi)外成像 Ⅱ . 報(bào)告基因的 PET成像技術(shù) 干細(xì)胞通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)告基因胸苷激酶 (ttk)，正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描 (Positron emission tomography, PET) 能監(jiān)測(cè)細(xì)胞的存活和遷移。 圖 12： 18FFHBG和 18FFDG 的 PET成像監(jiān)測(cè)體內(nèi)細(xì)胞存活 Ⅲ . 納米鐵粒子標(biāo)記干細(xì)胞技術(shù) 利用磁共振成像（ Magic resonance imaging, MRI），通過(guò)對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記在體外標(biāo)記鐵納米顆粒（ Feridex），可以監(jiān)測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)的過(guò)程（ Stem Cells， 2020；圖 13），為體內(nèi)有效評(píng)價(jià)干細(xì)胞歸巢、分化、再生、修復(fù)等奠定了良好基礎(chǔ)。 2. 研究多能干細(xì)胞 /間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新與定向分化為胰島祖細(xì)胞和腎祖細(xì)胞的細(xì)胞模型及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子功能分析平臺(tái)；研究胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島祖細(xì)胞，腎祖細(xì)胞之間的小 RNA表達(dá)差異，構(gòu)建關(guān)鍵的差異表達(dá)小 RNA文庫(kù)，完成小 RNA高表達(dá)或抑制的高通量轉(zhuǎn)染。 3. 建立 ESC、 MSC 和胰腎干 /祖細(xì)胞在小動(dòng)物中的分子影像監(jiān)測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于糖尿病和腎病的細(xì)胞治療。 3. 利用報(bào)告基因系統(tǒng)，建立監(jiān)測(cè) MSC, ESC在體內(nèi)的功能；初步建立組織特異的分子成像系統(tǒng)。 2. 篩選出 510 個(gè)在多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的自 我更新維持和向胰島祖細(xì)胞和腎祖細(xì)胞定向分化相關(guān)的 sRNA/miRNA 分子，并通過(guò) RTPCR, qPCR, Northern, westernblot 等多種方式鑒定與驗(yàn)證這些小RNA 的靶基因。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. ES 向胰腺干 /祖細(xì)胞分化過(guò)程中啟動(dòng) 子區(qū)域表觀遺傳學(xué)變化研究； microRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺干細(xì)胞，研究這些基因、 microRNA對(duì)胰腺干細(xì)胞的影響；分析多潛能干細(xì)胞和胰腎干 /祖細(xì)胞在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳狀態(tài)的差異，選擇關(guān)鍵的核心轉(zhuǎn)錄因子或表觀調(diào)控分子；構(gòu)建并轉(zhuǎn)染篩選得到啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的人 ESC 系。 4. 開(kāi)展糖尿病及糖尿 病腎病的動(dòng)物模型研究。制定干細(xì)胞治療的合理移植策略，結(jié)合組織工程的方法引入水凝 膠和兩種細(xì)胞聯(lián)合移植，提高干細(xì)胞治療效果。 3. 建立 ESC、 MSC 和胰腎干 /祖細(xì)胞在體內(nèi)向胰島祖細(xì)胞、腎祖細(xì)胞分化的分子影像監(jiān)測(cè)系統(tǒng)；將 ESC、 MSC 應(yīng)用于大動(dòng)物疾病模型的治療。 3. 建立大動(dòng)物的報(bào)告基因系統(tǒng)。 3. 建立大動(dòng)物報(bào)告基因和符合臨床應(yīng)用要求的分子影像系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)前述三個(gè)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析、總結(jié)，最終闡明在胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞向胰和腎干 /祖細(xì)胞分化過(guò)程中，以關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為核心， sRNA/microRNA 和組蛋白、 DNA 表觀遺傳修飾系統(tǒng)參與組成的三維分子網(wǎng)絡(luò)。并對(duì)上述誘導(dǎo)得到的特異性標(biāo)志的胰腎干 /祖細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并驗(yàn)證某些決定分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子在分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的作用及其在細(xì)胞發(fā)育特定階段的意義。 。 3. 胰腎干 /祖細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)功能的影像學(xué)評(píng)價(jià) ：綜合利用生物熒光、 PET及MRI在體成像技術(shù)，并結(jié)合組織切片染色和免疫組織化學(xué)等方法，檢測(cè)各種細(xì)胞標(biāo)志物體內(nèi)分化及與宿主整合，立體重構(gòu)和功能重建，為優(yōu)化糖尿病移植用干細(xì)胞的篩選、活體全程組織再生修復(fù)有效性提供科學(xué)評(píng)價(jià)。 4. 明確誘導(dǎo)后胰腎干祖細(xì)胞治療糖尿病腎病動(dòng)物模型的有效性。 1. 進(jìn)一步完善多潛能干細(xì)胞向胰腎干 /祖細(xì)胞的分化體系。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 五 年 1. 開(kāi)發(fā)新的多能干細(xì)胞向胰腺誘導(dǎo)分化方案。 1. 明確候選關(guān)鍵分子在多潛能干細(xì)胞向胰腎分化過(guò)程中的生物學(xué)功能；發(fā)現(xiàn)與胰腺干細(xì)胞密切相關(guān)的新基因；通過(guò)對(duì)關(guān)鍵調(diào)控分子的干預(yù)，進(jìn)一步完善多潛能干細(xì)胞向胰腎干 /祖細(xì)胞的分化體系。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 1. 對(duì)得到的調(diào)控因素進(jìn)行功能驗(yàn)證；用帶有相關(guān)基因、 microRNA 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺干細(xì)胞，研究這些基因、 microRNA對(duì)胰腺干細(xì)胞的影響；對(duì)得到的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) EGFP 表達(dá)的人 ESC 系進(jìn)行 ES 特性和相關(guān)分化特性的驗(yàn)證；分選細(xì)胞群用于下游相關(guān)研究；基于以上研究結(jié)果，開(kāi)發(fā)新的多能干細(xì)胞向胰腺誘導(dǎo)分化方案。 2. 建立小 RNA, 關(guān)鍵靶基因和相關(guān) DNA 甲基化的三維圖譜以及其相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；闡明表觀遺傳學(xué)調(diào)控對(duì) sRNA/miRNA 和轉(zhuǎn)錄因子的影響，獲得一個(gè)由表觀遺傳學(xué)相關(guān)因素及轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的調(diào)控向胰腺和腎臟祖細(xì)胞分化的三維分子網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)處于不同分化階段的胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島祖細(xì)胞或腎祖細(xì)胞中全基因組的甲基化的測(cè)定（ meDIPseq 測(cè)序），確定 DNA甲基化的位點(diǎn)，并利用 CHIP， RTPCR和 Westerb blotting等多種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證相關(guān)基因的 DNA 甲基化變化和干細(xì)胞的自我更新與定向分化的關(guān)系，獲得關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子上游的表觀遺傳調(diào)控因素；通過(guò)對(duì)內(nèi)源性小 RNA 的高表達(dá)或抑