【正文】 及有機(jī)溶劑 ， 將待測(cè)物質(zhì)組分從樣品基體中提取出來(lái)的一種方法 ， 是由密閉容器中酸硝解樣品和液固萃取有機(jī)物兩種技術(shù)相結(jié)合演變出來(lái)的 ， 其能在短時(shí)間內(nèi)完成多種樣品組分的萃取 ， 溶劑用量少 ， 結(jié)果重現(xiàn)性好 [10]。它兼?zhèn)溆袣怏w低粘度、高擴(kuò)散和流體的高密度、大溶解度兩方面的特點(diǎn) [8]。蝦殼中的蝦青素大多與蛋白質(zhì)結(jié)合 ， 應(yīng)用堿液脫蛋白的原理 ， 當(dāng)用熱堿液煮蝦殼時(shí) ， 蛋白質(zhì)溶出 ， 蝦青素也隨著溶出 ， 從而達(dá)到提取蝦青素的目的。提取高梁紅色 素是用%的鹽酸水溶液浸泡 2h， 除去雜質(zhì)和雜色后 ，再用 7%的乙醇水溶液在 40℃ 下浸提 ，然后過(guò)濾、濃縮、干燥而得 [6]。 對(duì)天然 產(chǎn)物 性質(zhì)的研究 ， 首先應(yīng)考慮毒理學(xué)的評(píng)價(jià)或安全性 ， 其次是 天然產(chǎn)物 的理化性 ， 主要包括 ： pH 值、光照、溫度以及食品中金屬離子、碳水化合物和添加劑的影響 ，天然產(chǎn)物 的抑菌活性、光譜性質(zhì)和抗氧化還原能力等 [5]， 同時(shí)隨著近代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展 ，人們要從分子水平上去認(rèn)識(shí)天然 產(chǎn)物 ， 包括它的結(jié)構(gòu)和分子方面的性質(zhì) ， 這樣就能更好的了解天然 產(chǎn)物 的性質(zhì)和應(yīng)用范圍。 我國(guó)天然 產(chǎn)物 的 研究和應(yīng)用現(xiàn)狀 天然 產(chǎn)物 的 研究方法 天然 產(chǎn)物 的獲得和生產(chǎn)主要有 三 條途徑 ： 一是直接提取 ； 二是人工合成 ； 三是利用生物技術(shù)生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，得出除雜效果好、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、能耗低，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)相似天然產(chǎn)物的除雜需要的操作方法，為天然產(chǎn)物研究工作者提供參考。 Heating。 參考文獻(xiàn) ...................................................................................................................30 I 天然產(chǎn)物提取液中蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)的去除試驗(yàn) 摘要 ： 利用蛋白質(zhì)分子的熱變性和低溫脫脂原理對(duì)迎春花和連翹花提取液進(jìn)行處理， 根據(jù)提取液處理前后的紫 外吸收光譜 和高效液相色譜 的不同 以及 對(duì)有機(jī)玻璃上色 效果的對(duì)比 ；考察了 除雜效果 。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)天然產(chǎn)物提取液進(jìn)行冷凍、加熱、離心處理能夠有效除去提取液中的蛋白質(zhì)和脂肪等大分子雜質(zhì)。 Freezing。 2 第一章 緒論 天然產(chǎn)物的介紹 天然產(chǎn)物是指動(dòng)物、植物、昆 蟲(chóng)、海洋生物和微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物以及人和動(dòng)物體內(nèi)許多 內(nèi)源性的化學(xué)成分。目前絕大多數(shù)品種的天然 產(chǎn)物 是采用直接提取方法生產(chǎn)的。通過(guò)對(duì) 天然產(chǎn)物 分子性質(zhì)的研究 ， 人們就可以更好地指導(dǎo)其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 ， 為 天然產(chǎn)物 工業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。利用有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取姜黃得姜黃色素 [7]， 將蝦殼用鹽酸浸泡 24h 后過(guò)濾 ， 濾渣用 95%乙醇浸泡提取液經(jīng)蒸餾后得到濃縮的粗制蝦青素提取物。辣椒紅色素的堿提取是以 15% 40%的 NaOH 水溶液處理辣椒油樹(shù)脂 ，使辣椒紅色素中的脂肪成分發(fā)生皂化反應(yīng) ， 從而將辣椒紅色素游離釋放出來(lái) ， 再分離精制可得到產(chǎn)品。由于超臨界 2CO 提取工藝簡(jiǎn)單 ， 能耗低 ， 萃取劑便宜 ， 提取的產(chǎn)品具有純度高 ， 溶劑殘留少 ， 無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn) ， 越來(lái)越受到人們的重視。微波萃取克服了超臨界萃取和溶劑萃取方法的上述缺陷 ， 既降低了操作費(fèi)用 ， 又符合環(huán)境4 保護(hù)的要求 ， 表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛力。結(jié)果表明 ， 采用分子蒸餾法 ，從脫蠟的甜橙油中一步提取的色素 ， 不含有機(jī)溶劑 ， 純度高 ， 色價(jià)高。 (7)高效液相色譜 (HPLC) 技術(shù) HPLC 是一種以液體為流動(dòng)相的現(xiàn)代柱色譜分離分析技術(shù)。 (8)酶法提取法 纖維素酶可使纖維素、半纖維素等物質(zhì)降解 ， 引起細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生局部疏松、膨脹等變化 ， 從而增大胞內(nèi)有效成分向提取介質(zhì)的擴(kuò)散 ， 促進(jìn) 天然產(chǎn)物 提取效率的提高。在色素分離中 ， 利用色素與雜質(zhì)分子大小的差異 ， 5 采用纖維超濾膜和反滲透膜 ， 可阻留各種不溶性大分子如多糖、蛋白質(zhì)等。 目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出 80 余種不同原料來(lái)源的食用天然色素。經(jīng)過(guò) 20 多年的努力 ， 我國(guó)的食用色素產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模 ， 成為食品工業(yè)中的一個(gè)重要行業(yè)。這些食品天然色素產(chǎn)品除在國(guó)內(nèi)銷(xiāo)售外 ， 還遠(yuǎn)銷(xiāo)國(guó)外。 天然 產(chǎn)物 的 發(fā)展前景 隨著我國(guó)食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)的發(fā)展 ， 天然 產(chǎn)物 的市場(chǎng)需求量將大幅度增加 ， 新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大 ， 使得天然產(chǎn)物 市場(chǎng)具有廣闊的發(fā)展前景。特別是一些農(nóng)產(chǎn)品 ， 如玉米、高粱、辣椒、蘿卜等更是隨處可見(jiàn) ， 這就為天然 產(chǎn)物 的開(kāi)發(fā)利用提供了豐富的原料 ， 也為農(nóng)副產(chǎn)品的深加工開(kāi)辟了新的途徑。紅曲米中含有降血脂物質(zhì)酪伐它汀 ， 作為著色劑用于食品中 ，可以有效地使人體內(nèi)血脂達(dá)到正常平 衡不少以類(lèi)黃酮為天 然色素的物質(zhì)有抗氧化功能或軟化血管功能。在天然 色素 的生產(chǎn)過(guò)程中 ， 可以采用的高新技術(shù)有 ： 基因工程、細(xì)胞工程、發(fā) 酵工程、吸附色譜、凝膠過(guò)濾、微孔過(guò)濾、超濾、電滲析、反滲透、膜分離技術(shù)、超臨界流體萃取分離技術(shù) ( 2CO 、 丙烷 )、冷凍干燥等技術(shù)。我國(guó)各天然色素生產(chǎn)企業(yè)一般規(guī)模都偏小 ， 產(chǎn)品單一 ， 在小量、低質(zhì)量、高損耗中徘徊 ， 經(jīng)濟(jì)效益不明顯 ， 抗風(fēng)險(xiǎn)能力 差。我們應(yīng)當(dāng)奮進(jìn)直追 ， 迎頭趕上。許多天然色素生產(chǎn)的原料是野生植物、農(nóng)作物副產(chǎn)品或廢棄物。辣椒的種子可以提取辣椒堿及辣椒油 ， 殘?jiān)叩鞍?； 辣椒種皮可以提取辣椒紅色素、辣椒堿 ， 殘?jiān)倥渖厦驷u、油、鮮味劑 ， 可精制辣醬。我國(guó)是一個(gè)占世界人口四分之一的、具有 13 億人口的大國(guó) ， 因此 ， 這樣多的人口 ， 要進(jìn) 入 一日三餐的加工食品時(shí)代 ， 需要的食用天然色素是很大的。 8 天然產(chǎn)物 提取液的精制 方法 隨著科技的發(fā)展和生活水平的提高 ， 天然產(chǎn)物 以其健康、安全的特點(diǎn)，將越來(lái)越受人們的歡迎， 但 天然產(chǎn)物大多不能直接使用，而 只需要其中的某些 物質(zhì)，因此需要對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行提取分離，提取后所得提取液大多數(shù)是混合物，需 利用體系中各組分物性的差別，使用 不同的方法使混合物得到分離提純。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中 ， 再浸入透析液進(jìn)行分離。由于超濾過(guò)程中 ， 濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞 ，以致超濾速度減慢 ， 截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小。例如 ， 在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中 ， 加入纖維素酶和 ? 淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后 ， 再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離 [13]。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白 ， 得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。但在同一條件下 ， 不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度 ， 根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn) ， 適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件 ， 就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度 ， 達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的 pH 值來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。李鳳英等測(cè)得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為 。 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象 ， 其中 ， 增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱(chēng)鹽溶 ， 反之為鹽析。由于硫酸銨在水中呈酸性 ， 為防止其對(duì)蛋白10 質(zhì)的破壞 ， 應(yīng)用氨水調(diào) pH 值至中性。例如 ， 在冰浴中磁力攪拌下 ， 在 4℃ 預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇 (25℃ )， 可以使冰核蛋白析出 ， 從而純化冰核蛋白。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由 Cohn 于 1949 年提出 ，用于制備丙種球蛋白。此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行 ， 雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 ， 收率較高。 反膠團(tuán)萃取法是利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)包裹其中而達(dá)到提取蛋白質(zhì)的目的。 (3)根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離純化 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類(lèi)。等電聚焦是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù) ， 也可以用于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ， 聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低 ， 加樣量不高 ； 等電 聚焦電泳分辨率最高 ， 可以分離同種蛋白的亞成分 ， 加樣量最小 ； 等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高 ， 可將樣品分成單一成分 ， 加樣量最大。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。李全宏等 [18]將離子交換層析應(yīng)用于濃縮蘋(píng)果汁中蛋白質(zhì)的提純。應(yīng)用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性 ， 以便設(shè)計(jì)出最好的分離條件。該方法成本較低 ， 吸附劑價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度高、抗污染能力較強(qiáng)、非特異性吸附較小、可反復(fù)使用、適用性廣 ， 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 。一是結(jié)晶溫度和冷卻速率。達(dá)到穩(wěn)定晶型需要足夠的時(shí)間 ， 延長(zhǎng)結(jié)晶時(shí)間有利于穩(wěn)定晶型的形成和成長(zhǎng)。故攪拌速度要適宜 ， 要根據(jù)冷凍結(jié)晶操作的不同階段而調(diào)節(jié) ， 以有利于晶粒的形成與成長(zhǎng)為度。 由于離心機(jī)等設(shè)備可產(chǎn)生相當(dāng)高的角速度，使離心力遠(yuǎn)大于重力，于是溶液中的懸浮物便易于沉淀析出： 又由于比重不同的物質(zhì)所受到的離心力不同，從而沉降速度不同，能使比重不同的物質(zhì)達(dá)到分離。若改用離心分離，由于轉(zhuǎn)鼓高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力遠(yuǎn)遠(yuǎn)13 大于重力，可大大提高沉降速率，因此離心分離只需較短的時(shí)間即能獲得大于重力沉 降的效果。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的離心操作，就可以實(shí)現(xiàn)密度不同物質(zhì)的有效分離。離心后把上清液與沉淀分開(kāi)，然后再將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。 儀器和試劑 實(shí)驗(yàn)儀器 BCD271SDJ 冰箱 (青島海爾股份有限公司 ) SUY22600DT 超聲清洗機(jī) （鄭州生元儀器有限公司） 玻璃儀器氣流烘干器 （河南智城科技發(fā)展有限公司） HH501 超級(jí)恒溫水浴 （常州國(guó)華電器有限公司） FA 1004B 電子分析天平 （上海佑科儀器儀表有限公司） 852A 雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 （金壇市杰瑞爾電器有限公司） 電子溫度計(jì) （南京好又多電器有限公司） TDL802B 臺(tái)式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠） T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司） Agilent 1200LC 高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫科技有限公司） 主要試劑 高純 水（ Water） 408 制備 無(wú)水乙醇（ Ethanol absolute） AR(天津市富宇精細(xì)化工有限公司 ) 氫氧化鈉（ Sodium hydroxide） AR(天津市登科化學(xué)試劑有限公司 ) 乙腈（ Acetonitrile） 色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠） 有機(jī)玻璃 (PMMA) 市售 分析方法 用紫外分光光度計(jì)掃描迎春花、連翹提取液稀釋 100 倍后的吸收光譜 。 16 第三章 結(jié)果與討論 溫度控制條件的確定 圖 和圖 為水的冷凍和加熱曲線。 0 1 2 3 4 5 6 72345678910Temperature/℃Tim e /m in 圖 迎春花原液 3℃ 降溫曲線 18 0 1 2 3 4 5 6 7234567891011Temperature/℃Tim e /h 圖 連翹花原液 3℃ 降溫曲線 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 182530354045Temperature/℃Tim e /m in 圖 迎春花原液 45℃ 升溫曲線