【正文】 30天，染毒及實(shí)驗(yàn)觀察期 再進(jìn)行大體解剖、血液、生化、器官病 理檢查。 如三項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性，則可繼續(xù)進(jìn)行下一步的毒性試驗(yàn)。 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn) 時(shí)間周期 ：一般為 7周 35天適應(yīng)期 小鼠經(jīng)口連續(xù)染毒 5天，與首次給樣后的 1214天處死動(dòng)物取材，（取材前 6h，腹腔注 射秋水仙素）。 結(jié)果評(píng)價(jià) ： 受試物組與對(duì)照組精子畸變率相比，增高呈劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。 原理 ： 小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及 X、 Y性染色體基因決定精子形態(tài)。 取股骨，收集骨髓，制片，染色，鏡檢 劑量設(shè)計(jì) ：同骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 觀察及評(píng)價(jià)指標(biāo) ： 每只動(dòng)物分析 100個(gè)中期相細(xì)胞 ，每個(gè)劑量組不少于1000個(gè)。 原理 ：當(dāng)受試物作用于細(xì)胞周期 G1期和 S期時(shí)，可誘發(fā)染色體型畸變，而作用于 G2期時(shí)則誘發(fā)染色體單體型畸變。 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 觀察及評(píng)價(jià)指標(biāo) ： 每只動(dòng)物計(jì)數(shù) 1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞 ，記錄含有微核的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算微核千分率。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 目的 ： 檢測(cè)整體動(dòng)物體內(nèi)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率，以評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性?？稍O(shè)五個(gè)劑量組，組間距不超過(guò) 5倍。 2. LD50≥10g/kgbw 或按最大耐受量染毒而未出現(xiàn)動(dòng)物死亡的，可繼續(xù)下一步試驗(yàn)。致死劑量通常用半數(shù)致死劑量 LD50表示。 如僅以該原料生產(chǎn)的，可申請(qǐng)免做毒理學(xué)試驗(yàn)。 樣品的預(yù)處理原則 處理方法與產(chǎn)品推薦飲用方法相同 推薦用： 80℃ 90℃ 常壓用水浸泡 30min 水量為受試物的 10倍，提取 2次， 2次提取液合并濃縮至所需濃度 標(biāo)明該濃縮液與受試物的比例 樣品的預(yù)處理原則 （ 1）不需濃縮的受試物 乙醇濃度 15％ 直接進(jìn)行試驗(yàn) 乙醇濃度 15％ 乙醇濃度應(yīng)調(diào)至 15％ （ 2）需濃縮的受試物 乙醇濃度 15％ 濃縮后調(diào)至原乙醇濃度 乙醇濃度 15％ 濃縮后調(diào)至 15％乙醇濃度 在進(jìn)行乙醇濃度調(diào)整時(shí)必須用原酒基 樣品的預(yù)處理原則 選擇可溶性介質(zhì) 給受試物的方法：灌胃 其最高濃度最大灌胃量時(shí)達(dá)不到人體推薦量的 100倍，按采用實(shí)際達(dá)到的倍數(shù) 標(biāo)明受試物的膨脹系數(shù) 樣品的預(yù)處理原則 在進(jìn)行 Ames試驗(yàn)或體外細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)需將受試物滅活。 常用的介質(zhì)有：蒸餾水、食用植物油、淀粉、明膠及羧甲基纖維素等。 ? 衛(wèi)生部規(guī)定允許使用的動(dòng)植物及其提取物或微生物為原料的。 ： ? 一、二階段試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外產(chǎn)品不一致的 ? 國(guó)外少數(shù)國(guó)家或地區(qū)食用的原料或成分 ? 水提取物，大于常規(guī)服用量 ? 用水提以外的其它常用工藝生產(chǎn)的，大于常規(guī)用量 選擇毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則 國(guó)內(nèi)外均無(wú)食用先例 不同食用人群和（或）不同功能的保健食品 選擇毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則 對(duì)受試保健食品的要求 ? 單一已知化學(xué)成分，應(yīng)提供物理和化學(xué)性質(zhì) ? 多種原料的配方產(chǎn)品，應(yīng)提供配方 ? 配方產(chǎn)品，必要時(shí)還應(yīng)提供各組分，功效成分的 ? 物理和化學(xué)性質(zhì)及其檢測(cè)報(bào)告 ? 提供原料來(lái)源、生產(chǎn)工藝、人的可能攝入量。 受試物濃縮倍數(shù)應(yīng)符合試驗(yàn)要求。 需濃縮的應(yīng)采用低溫干燥法或由企業(yè)提供所需濃度的受試物（附方法、技術(shù)參數(shù)）。 毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目要點(diǎn)介紹 ? 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) ? 鼠傷寒沙門氏菌（ Ames）試驗(yàn) ? 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) ? 哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) ? 小鼠精子畸形試驗(yàn) ? 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn) ? 30天喂養(yǎng)試驗(yàn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 目的： 測(cè)定 LD50，毒性分級(jí)。 急性聯(lián)合毒性：兩種或兩種以上的受試物，可能發(fā)生拮抗、相加或協(xié)同的聯(lián)合方式，可以根據(jù)一定的公式計(jì)算和判定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定這三種不同的作用。 鼠傷寒沙門氏菌（ Ames）試驗(yàn) 目的： 檢測(cè)受試物的誘變性，預(yù)測(cè)其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。同時(shí)設(shè)：陽(yáng)性對(duì)照組，溶劑對(duì)照組和未處理對(duì)照組。 原理 ： 微核是在細(xì)胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的色單體或染色體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片 。一般取 LD50的 1/ 1/ 1/8作為三個(gè)劑量。同時(shí)觀察嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例。給動(dòng)物腹腔注射秋水仙素，抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成，增加中期分裂相細(xì)胞的比例，并使染色體絲縮短、分散，輪廓清晰。記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn) 目的 ：檢測(cè)整體動(dòng)物睪丸染色體畸變發(fā)生率，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)整體哺乳動(dòng)物睪丸生殖細(xì)胞的致突變性。取兩側(cè)睪丸，收集生殖細(xì)胞，滴片，染色，鏡檢 劑量設(shè)計(jì) ：同骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn) 觀察及評(píng)價(jià)指標(biāo) ： 每只動(dòng)物分析 100個(gè)中期相細(xì)胞 ，記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變（包括斷片、易位、畸變細(xì)胞率、常染色體單價(jià)體、性染色體單價(jià)體等）。 30天喂養(yǎng)試驗(yàn) 目的 ：急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，此試驗(yàn)可進(jìn)一步了解毒性作用，特別是觀察對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，并可初步估計(jì)最大觀察到的無(wú)作用劑量，估計(jì)亞慢性攝入的危害性。 30天喂養(yǎng)試驗(yàn) 劑量設(shè)計(jì) ：至少設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。 對(duì)于不能獲得 LD50的受試物 ：最高劑量為人可能攝入量的 100倍，或按最大灌胃劑量或在飼料中的最大摻入量。 生化學(xué)指標(biāo) ：喂養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌肝、血糖、白蛋白、總蛋白、膽固醇和甘油三酯。 在中低劑量組中個(gè)別指標(biāo)與對(duì)照組相比有差異，應(yīng)綜合分析，決定取舍或進(jìn)行下一步毒理試驗(yàn)。 ，需大于或等于人攝入量的 300倍。 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均發(fā)生腫瘤，但實(shí)驗(yàn)組發(fā)生率高。 結(jié)論 ：在對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行科學(xué)地安全性評(píng)價(jià)之后，應(yīng)結(jié)合試驗(yàn)的局限性，社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況，人們的生活習(xí)慣等因素，對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果作出一個(gè)合理的分析，為衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供具有實(shí)際指導(dǎo)意義的依據(jù)。 對(duì)孕婦、乳母或兒童食用的保健食品，應(yīng)特別注意其胚胎毒性或生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。 鑒于動(dòng)物、人的種屬和個(gè)體之間的生物學(xué)差異，安全系數(shù)通常為 100。 （ 10％）或液體受試物經(jīng)濃縮后仍達(dá)不到最大觀察到有害作用劑量為人的可能攝入量的規(guī)定倍數(shù)時(shí)，如何綜合其它的毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。 （ 3）未提供某些試驗(yàn)數(shù)據(jù)，需要補(bǔ)充提供。 （ 3）選擇安全性毒理學(xué)試驗(yàn)不符合程序規(guī)定，未完成相應(yīng)階段的毒理學(xué)試驗(yàn)。 (二 )： 第三部分 保健食品新原料安全性 毒理學(xué)評(píng)價(jià)原則 保健食品新原料（以下簡(jiǎn)稱新原料）是指不在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品、衛(wèi)生部公布或批準(zhǔn)可以食用以及生產(chǎn)普通食品的范圍內(nèi)，擬用于保健食品的原料。 新原料安全性毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目的選擇 ①無(wú)食用史 需做四階段試驗(yàn) ②局部地區(qū)有食用史 需做三階段試驗(yàn) 可只做一、二階段實(shí)驗(yàn)的包括 1） 推薦食用量未超過(guò)人群常規(guī)用量的新原料，若根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)資料及成分分析，未發(fā)現(xiàn)有毒或毒性甚微不至對(duì)健康構(gòu)成損害，或者較大數(shù)量人群有長(zhǎng)期食用歷史且未發(fā)現(xiàn)有害作用的 2）已有權(quán)威機(jī)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，且有資料證明所用原料與其一致 如試驗(yàn)結(jié)果與權(quán)威機(jī)構(gòu)進(jìn)行的評(píng)價(jià)不一致，需進(jìn)入下階段的試驗(yàn) 新原料安全性毒理學(xué)試驗(yàn)要求 新原料安全性毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目的選擇 ③ 多個(gè)國(guó)家或國(guó)內(nèi)多數(shù)地區(qū)廣泛食用 1）推薦食用量未超過(guò)人群常規(guī)用量：先進(jìn)行第一、二階段毒性試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果決定是否進(jìn)行下一階段毒理學(xué)試驗(yàn) 2）推薦食用量超過(guò)人群常規(guī)用量：進(jìn)行第一、二、三階段的毒性試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果決定是否進(jìn)行第四階段毒性試驗(yàn)。 若根據(jù)已掌握的資料（包括第一、二階段的毒性試驗(yàn)及預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果等）判定新原料毒性較小，或人體推薦量較大，則試驗(yàn)最高劑量應(yīng)為可給予的最大劑量（即：飼料中最大摻入量或最大灌胃濃度下一次最大灌胃量）。 符合既定的配方 ， 生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 。 存在的問(wèn)題 ? 動(dòng)物年齡 主要指 30天和 90天喂養(yǎng)試驗(yàn) ， “ 程序 ” 中規(guī)定用離乳大鼠 ， 而保健食品應(yīng)視具體情況而異 。 存在的問(wèn)題 ? 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的選擇 3. 藥食同源產(chǎn)品經(jīng)有機(jī)溶劑提取未做毒理試驗(yàn) ，或只做 LD50和微核試驗(yàn) 。 。 。 存在的問(wèn)題 ? 微核 、 精子畸形以及睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn) ：幾份報(bào)告中都有陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)據(jù) ，而這幾份原始記錄中皆無(wú)陽(yáng)性對(duì)照 。 存在的問(wèn)題 ? 30天或 90天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 177。 177。 177。 177。 177。 1 2 3 4 5 雄（ n=30) 雌（ n=30) 雄（ n=30) 雌（ n=30) 體重 (g) 周齡 （周） 體重 (g) 周齡 （周） 上表為 SD大鼠正常體重 存在的問(wèn)題 ? 30天或 90天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn) ， 或?yàn)閷⒋?、 雄性大鼠食物利用率拉開差距 ， 雌性和雄性大鼠的進(jìn)食量基本一致 。 ：不做 TG、 AST； TC高達(dá) ；。 第五部分 保健食品功能性檢驗(yàn)及評(píng)價(jià) 主要內(nèi)容 ? 基本要求 （ 一般程序 ） ? 動(dòng)物功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 ? 人體功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 ? 各功能學(xué)試驗(yàn)主要指標(biāo)評(píng)審要求 保健食品功能評(píng)價(jià)的基本要求 提供樣品物理、化學(xué)性質(zhì)的有關(guān)資料 必須是規(guī)格化的定型產(chǎn)品 提供衛(wèi)生學(xué)和毒理學(xué)檢驗(yàn)報(bào)告，樣品必須同一批次 提供功效成分和特征成分或營(yíng)養(yǎng)成分的名稱及含量 以乙醇和糖為載體的樣品必須提供乙醇和糖的含量 所提供的受試物為組成成分、比例及純度與實(shí)際產(chǎn)品相同的樣品；必須在保質(zhì)期內(nèi)。 ? 以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須有相當(dāng)于人體推薦量 （ 折算為每公斤體重 ） 的 5倍劑量組 。 動(dòng)物功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 人體功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 （ 1） 合理選擇受試者 按照 《 保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 （ 2023年 ）》 規(guī)定的試驗(yàn)對(duì)象納入與排除標(biāo)準(zhǔn) ， 并同時(shí)考慮試食設(shè)計(jì)要求 、 受試樣品的性質(zhì)等因素 。 人體功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 （ 1） 保證受試對(duì)象的食用安全 。 開始時(shí)間應(yīng)晚于其它試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間 。 ? 常規(guī)的血液學(xué)指標(biāo) ? 生化指標(biāo) ? 功效性指標(biāo) ， 即與保健作用有關(guān)的指標(biāo) ， 如抗氧化 、 減肥等方面的指標(biāo) 。 （ 5） 如需與醫(yī)院共同完成的試驗(yàn) ， 必須選擇三級(jí)甲等醫(yī)院 ，報(bào)告中應(yīng)同時(shí)加蓋兩單位公章 ， 同時(shí)需提供三級(jí)甲等醫(yī)院的等級(jí)證明 。 各功能試驗(yàn)審評(píng)要點(diǎn) 2. 改善睡眠功能檢驗(yàn)方法 主要指標(biāo)：戊巴比妥納睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 戊巴比妥鈉 （ 或巴比妥鈉 ） 閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 判定： 3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任 2項(xiàng)陽(yáng)性 ， 且直接睡眠作用 。 （ 2） 在負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)時(shí) ， 酒類樣品測(cè)試當(dāng)天可以不灌胃 。 注意事項(xiàng)：選用小鼠 ， 受