【正文】 30天，染毒及實驗觀察期 再進(jìn)行大體解剖、血液、生化、器官病 理檢查。 如三項試驗均為陰性，則可繼續(xù)進(jìn)行下一步的毒性試驗。 小鼠睪丸染色體畸變試驗 時間周期 ：一般為 7周 35天適應(yīng)期 小鼠經(jīng)口連續(xù)染毒 5天，與首次給樣后的 1214天處死動物取材，（取材前 6h，腹腔注 射秋水仙素）。 結(jié)果評價 ： 受試物組與對照組精子畸變率相比，增高呈劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗結(jié)果為陽性。 原理 ： 小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及 X、 Y性染色體基因決定精子形態(tài)。 取股骨，收集骨髓，制片，染色，鏡檢 劑量設(shè)計 ：同骨髓細(xì)胞微核試驗 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗 觀察及評價指標(biāo) ： 每只動物分析 100個中期相細(xì)胞 ，每個劑量組不少于1000個。 原理 ：當(dāng)受試物作用于細(xì)胞周期 G1期和 S期時，可誘發(fā)染色體型畸變，而作用于 G2期時則誘發(fā)染色體單體型畸變。 骨髓細(xì)胞微核試驗 觀察及評價指標(biāo) ： 每只動物計數(shù) 1000個嗜多染紅細(xì)胞 ，記錄含有微核的細(xì)胞數(shù)，并計算微核千分率。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。 骨髓細(xì)胞微核試驗 目的 ： 檢測整體動物體內(nèi)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率，以評價受試物致突變的可能性?？稍O(shè)五個劑量組，組間距不超過 5倍。 2. LD50≥10g/kgbw 或按最大耐受量染毒而未出現(xiàn)動物死亡的，可繼續(xù)下一步試驗。致死劑量通常用半數(shù)致死劑量 LD50表示。 如僅以該原料生產(chǎn)的，可申請免做毒理學(xué)試驗。 樣品的預(yù)處理原則 處理方法與產(chǎn)品推薦飲用方法相同 推薦用： 80℃ 90℃ 常壓用水浸泡 30min 水量為受試物的 10倍，提取 2次， 2次提取液合并濃縮至所需濃度 標(biāo)明該濃縮液與受試物的比例 樣品的預(yù)處理原則 （ 1）不需濃縮的受試物 乙醇濃度 15％ 直接進(jìn)行試驗 乙醇濃度 15％ 乙醇濃度應(yīng)調(diào)至 15％ （ 2）需濃縮的受試物 乙醇濃度 15％ 濃縮后調(diào)至原乙醇濃度 乙醇濃度 15％ 濃縮后調(diào)至 15％乙醇濃度 在進(jìn)行乙醇濃度調(diào)整時必須用原酒基 樣品的預(yù)處理原則 選擇可溶性介質(zhì) 給受試物的方法：灌胃 其最高濃度最大灌胃量時達(dá)不到人體推薦量的 100倍，按采用實際達(dá)到的倍數(shù) 標(biāo)明受試物的膨脹系數(shù) 樣品的預(yù)處理原則 在進(jìn)行 Ames試驗或體外細(xì)胞試驗時需將受試物滅活。 常用的介質(zhì)有：蒸餾水、食用植物油、淀粉、明膠及羧甲基纖維素等。 ? 衛(wèi)生部規(guī)定允許使用的動植物及其提取物或微生物為原料的。 ： ? 一、二階段試驗結(jié)果與國外產(chǎn)品不一致的 ? 國外少數(shù)國家或地區(qū)食用的原料或成分 ? 水提取物，大于常規(guī)服用量 ? 用水提以外的其它常用工藝生產(chǎn)的，大于常規(guī)用量 選擇毒理學(xué)試驗的基本原則 國內(nèi)外均無食用先例 不同食用人群和（或）不同功能的保健食品 選擇毒理學(xué)試驗的基本原則 對受試保健食品的要求 ? 單一已知化學(xué)成分，應(yīng)提供物理和化學(xué)性質(zhì) ? 多種原料的配方產(chǎn)品，應(yīng)提供配方 ? 配方產(chǎn)品，必要時還應(yīng)提供各組分，功效成分的 ? 物理和化學(xué)性質(zhì)及其檢測報告 ? 提供原料來源、生產(chǎn)工藝、人的可能攝入量。 受試物濃縮倍數(shù)應(yīng)符合試驗要求。 需濃縮的應(yīng)采用低溫干燥法或由企業(yè)提供所需濃度的受試物（附方法、技術(shù)參數(shù)）。 毒理學(xué)試驗項目要點(diǎn)介紹 ? 急性經(jīng)口毒性試驗 ? 鼠傷寒沙門氏菌（ Ames）試驗 ? 骨髓細(xì)胞微核試驗 ? 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗 ? 小鼠精子畸形試驗 ? 小鼠睪丸染色體畸變試驗 ? 30天喂養(yǎng)試驗 急性經(jīng)口毒性試驗 目的： 測定 LD50，毒性分級。 急性聯(lián)合毒性：兩種或兩種以上的受試物，可能發(fā)生拮抗、相加或協(xié)同的聯(lián)合方式，可以根據(jù)一定的公式計算和判定標(biāo)準(zhǔn)來確定這三種不同的作用。 鼠傷寒沙門氏菌（ Ames）試驗 目的： 檢測受試物的誘變性，預(yù)測其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。同時設(shè)：陽性對照組，溶劑對照組和未處理對照組。 原理 ： 微核是在細(xì)胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片 。一般取 LD50的 1/ 1/ 1/8作為三個劑量。同時觀察嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例。給動物腹腔注射秋水仙素，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，增加中期分裂相細(xì)胞的比例，并使染色體絲縮短、分散，輪廓清晰。記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。 小鼠睪丸染色體畸變試驗 目的 ：檢測整體動物睪丸染色體畸變發(fā)生率，以評價受試物對整體哺乳動物睪丸生殖細(xì)胞的致突變性。取兩側(cè)睪丸，收集生殖細(xì)胞，滴片，染色，鏡檢 劑量設(shè)計 ：同骨髓細(xì)胞微核試驗 小鼠睪丸染色體畸變試驗 觀察及評價指標(biāo) ： 每只動物分析 100個中期相細(xì)胞 ，記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變（包括斷片、易位、畸變細(xì)胞率、常染色體單價體、性染色體單價體等）。 30天喂養(yǎng)試驗 目的 ：急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，此試驗可進(jìn)一步了解毒性作用，特別是觀察對生長發(fā)育的影響，并可初步估計最大觀察到的無作用劑量，估計亞慢性攝入的危害性。 30天喂養(yǎng)試驗 劑量設(shè)計 ：至少設(shè)三個劑量組和一個對照組。 對于不能獲得 LD50的受試物 ：最高劑量為人可能攝入量的 100倍，或按最大灌胃劑量或在飼料中的最大摻入量。 生化學(xué)指標(biāo) ：喂養(yǎng)結(jié)束后測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌肝、血糖、白蛋白、總蛋白、膽固醇和甘油三酯。 在中低劑量組中個別指標(biāo)與對照組相比有差異，應(yīng)綜合分析，決定取舍或進(jìn)行下一步毒理試驗。 ，需大于或等于人攝入量的 300倍。 實驗組和對照組均發(fā)生腫瘤，但實驗組發(fā)生率高。 結(jié)論 ：在對化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行科學(xué)地安全性評價之后，應(yīng)結(jié)合試驗的局限性，社會經(jīng)濟(jì)狀況，人們的生活習(xí)慣等因素，對評價結(jié)果作出一個合理的分析，為衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供具有實際指導(dǎo)意義的依據(jù)。 對孕婦、乳母或兒童食用的保健食品，應(yīng)特別注意其胚胎毒性或生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。 鑒于動物、人的種屬和個體之間的生物學(xué)差異，安全系數(shù)通常為 100。 （ 10％）或液體受試物經(jīng)濃縮后仍達(dá)不到最大觀察到有害作用劑量為人的可能攝入量的規(guī)定倍數(shù)時，如何綜合其它的毒性試驗結(jié)果進(jìn)行安全性評價。 （ 3）未提供某些試驗數(shù)據(jù)，需要補(bǔ)充提供。 （ 3）選擇安全性毒理學(xué)試驗不符合程序規(guī)定，未完成相應(yīng)階段的毒理學(xué)試驗。 (二 )： 第三部分 保健食品新原料安全性 毒理學(xué)評價原則 保健食品新原料（以下簡稱新原料）是指不在國家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品、衛(wèi)生部公布或批準(zhǔn)可以食用以及生產(chǎn)普通食品的范圍內(nèi)，擬用于保健食品的原料。 新原料安全性毒理學(xué)試驗項目的選擇 ①無食用史 需做四階段試驗 ②局部地區(qū)有食用史 需做三階段試驗 可只做一、二階段實驗的包括 1） 推薦食用量未超過人群常規(guī)用量的新原料，若根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)資料及成分分析，未發(fā)現(xiàn)有毒或毒性甚微不至對健康構(gòu)成損害，或者較大數(shù)量人群有長期食用歷史且未發(fā)現(xiàn)有害作用的 2）已有權(quán)威機(jī)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)安全性評價，且有資料證明所用原料與其一致 如試驗結(jié)果與權(quán)威機(jī)構(gòu)進(jìn)行的評價不一致，需進(jìn)入下階段的試驗 新原料安全性毒理學(xué)試驗要求 新原料安全性毒理學(xué)試驗項目的選擇 ③ 多個國家或國內(nèi)多數(shù)地區(qū)廣泛食用 1）推薦食用量未超過人群常規(guī)用量：先進(jìn)行第一、二階段毒性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果決定是否進(jìn)行下一階段毒理學(xué)試驗 2）推薦食用量超過人群常規(guī)用量：進(jìn)行第一、二、三階段的毒性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果決定是否進(jìn)行第四階段毒性試驗。 若根據(jù)已掌握的資料（包括第一、二階段的毒性試驗及預(yù)試驗的結(jié)果等）判定新原料毒性較小，或人體推薦量較大，則試驗最高劑量應(yīng)為可給予的最大劑量（即：飼料中最大摻入量或最大灌胃濃度下一次最大灌胃量）。 符合既定的配方 ， 生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 。 存在的問題 ? 動物年齡 主要指 30天和 90天喂養(yǎng)試驗 ， “ 程序 ” 中規(guī)定用離乳大鼠 ， 而保健食品應(yīng)視具體情況而異 。 存在的問題 ? 實驗項目的選擇 3. 藥食同源產(chǎn)品經(jīng)有機(jī)溶劑提取未做毒理試驗 ，或只做 LD50和微核試驗 。 。 。 存在的問題 ? 微核 、 精子畸形以及睪丸染色體畸變試驗 ：幾份報告中都有陽性對照的數(shù)據(jù) ，而這幾份原始記錄中皆無陽性對照 。 存在的問題 ? 30天或 90天喂養(yǎng)實驗 177。 177。 177。 177。 177。 1 2 3 4 5 雄（ n=30) 雌（ n=30) 雄（ n=30) 雌（ n=30) 體重 (g) 周齡 （周） 體重 (g) 周齡 （周） 上表為 SD大鼠正常體重 存在的問題 ? 30天或 90天喂養(yǎng)實驗 ， 或為將雌 、 雄性大鼠食物利用率拉開差距 ， 雌性和雄性大鼠的進(jìn)食量基本一致 。 ：不做 TG、 AST； TC高達(dá) ；。 第五部分 保健食品功能性檢驗及評價 主要內(nèi)容 ? 基本要求 （ 一般程序 ） ? 動物功能學(xué)試驗基本要求 ? 人體功能學(xué)試驗基本要求 ? 各功能學(xué)試驗主要指標(biāo)評審要求 保健食品功能評價的基本要求 提供樣品物理、化學(xué)性質(zhì)的有關(guān)資料 必須是規(guī)格化的定型產(chǎn)品 提供衛(wèi)生學(xué)和毒理學(xué)檢驗報告，樣品必須同一批次 提供功效成分和特征成分或營養(yǎng)成分的名稱及含量 以乙醇和糖為載體的樣品必須提供乙醇和糖的含量 所提供的受試物為組成成分、比例及純度與實際產(chǎn)品相同的樣品；必須在保質(zhì)期內(nèi)。 ? 以大鼠為實驗動物必須有相當(dāng)于人體推薦量 （ 折算為每公斤體重 ） 的 5倍劑量組 。 動物功能學(xué)試驗基本要求 人體功能學(xué)試驗基本要求 （ 1） 合理選擇受試者 按照 《 保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范 （ 2023年 ）》 規(guī)定的試驗對象納入與排除標(biāo)準(zhǔn) ， 并同時考慮試食設(shè)計要求 、 受試樣品的性質(zhì)等因素 。 人體功能學(xué)試驗基本要求 （ 1） 保證受試對象的食用安全 。 開始時間應(yīng)晚于其它試驗報告時間 。 ? 常規(guī)的血液學(xué)指標(biāo) ? 生化指標(biāo) ? 功效性指標(biāo) ， 即與保健作用有關(guān)的指標(biāo) ， 如抗氧化 、 減肥等方面的指標(biāo) 。 （ 5） 如需與醫(yī)院共同完成的試驗 ， 必須選擇三級甲等醫(yī)院 ，報告中應(yīng)同時加蓋兩單位公章 ， 同時需提供三級甲等醫(yī)院的等級證明 。 各功能試驗審評要點(diǎn) 2. 改善睡眠功能檢驗方法 主要指標(biāo)：戊巴比妥納睡眠時間實驗 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 戊巴比妥鈉 （ 或巴比妥鈉 ） 閾下劑量催眠實驗 判定： 3項實驗中任 2項陽性 ， 且直接睡眠作用 。 （ 2） 在負(fù)重游泳實驗時 ， 酒類樣品測試當(dāng)天可以不灌胃 。 注意事項：選用小鼠 ， 受