【正文】 ， 這是先設計再做試驗 ， 還是先做試驗再設計 ？ 18%， 袋泡茶摻入飼料給予動物 。 177。 177。 （ 正?；温蕿?%） 。 24小時 。 存在的問題 ? 實驗項目的選擇 1. 配方中含有僅限局部地區(qū)人群食用而又不在 “ 51號 ”名單上的原料 ， 只對產(chǎn)品進行了兩階段毒理試驗 ，而未對原料本身按要求進行毒理學評價 ， 有的進行了評價但給予動物受試物的方式與實際食用方式不一樣 ， 如袋泡茶摻在飼料中給予動物 。 第四部分 保健食品安全性毒理學 評價中存在的問題 存在的問題 鑒于制訂此程序的歷史背景與目前情況有所不同 ， 因此 ， 對保健食品的安全性評價時 ， 出現(xiàn)了選擇毒理試驗的項目 、 劑量 、 樣品前處理等問題 ， 現(xiàn)就上述問題一并提出供討論 。 保健食品新原料定義 在已批準的保健食品中使用過，或衛(wèi)生部已批準為新資源食品的原料，符合以下情況的仍按新原料進行管理： ?未列入國家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品的物品名單； ?尚未列入衛(wèi)生部公布或批準的食品新資源或新資源食品名單內(nèi)； ?衛(wèi)生部已批準為食品新資源或新資源食品，但保健食品注冊申請人與食品新資源或新資源食品生產(chǎn)批件中載明的申報單位不一致。 （ 1）毒理學評價的結果表明產(chǎn)品在推薦劑量下對人體具有一定的毒性，存在安全性問題。 在對保健食品進行最后評價時，必須綜合考慮受試物的原料來源、理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點、蓄積性、接觸的人群范圍、食品中的使用范圍、人的可能攝入量及保健功能等因素，確保其對人體健康的安全性。 對實驗中某些指標的異常改變，在結果分析時要注意區(qū)分是生理學表現(xiàn)還是受試物的毒性作用。 其它試驗結果判斷 ? 慢性毒性試驗 ： 以 LD50或 30天喂養(yǎng)試驗的最大未觀察到有害作用劑量設計受試物各劑量組，未見有毒性作用。 30天喂養(yǎng)試驗 試驗結果的判定 ： 對于只要求進行一、二階段試驗者，最大未觀察到有害作用劑量 ≥ 人可能攝入量的 100倍，綜合其它試驗結果可初步做出安全性評價。低劑量應不出現(xiàn)任何毒作用，同時在這二劑量之間設幾個中間劑量組。 遺傳毒性試驗組合 試驗結果的判定 ： 如三項致突變試驗（ Ames試驗，微核或骨髓細胞染色體畸變試驗，精子畸形或睪丸染色體畸變試驗）中，體外或體內(nèi)有一項或以上陽性，一般應放棄該受試物用于保健食品。 小鼠精子畸形試驗 時間周期 ：一般為 7周 35天適應期 小鼠經(jīng)口連續(xù)染毒 5天，于首次給樣后的 35天處死動物 取兩側附睪，收集精子，滴片，染色，鏡檢 劑量設計 ：同骨髓細胞微核試驗 小鼠精子畸形試驗 觀察及評價指標 ： 每只動物檢查 1000個精子 ，記錄精子畸形數(shù)目及類型。 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗 時間周期 ：一般為 3周 35天適應期 小鼠或大鼠經(jīng)口染毒 24次，每次間隔 24h，在末次染毒 1824h進行取材（取材前 24h，腹腔注射秋水仙素）。同時設陽性對照組和溶劑對照組。 結果評價（摻入法）： 受試物組回變菌落數(shù)增加一倍以上（即回變菌落數(shù)≥2 未處理對照組數(shù)），并有劑量反應關系或有可重復的陽性反應，即可判試驗陽性。 大體尸檢結果：如果發(fā)生死亡動物 急性毒性（ LD50）劑量分級表 級 別 大鼠口服 LD50， mg/kg 相當于人的致死量 mg/kg g/人 極毒 1 稍嘗 劇毒 150 5004000 中等毒 51500 400030000 5 低毒 5015000 30000250000 50 實際無毒 500115000 250000500000 500 無毒 15000 500000 2500 急性經(jīng)口毒性試驗 試驗結果的判定： 1. LD50＜人可能攝入量的 100倍，放棄；反之繼續(xù)下一步試驗。 （ 2）大豆蛋白、乳清蛋白 如質(zhì)量、工藝等符合食品標準和安全要求，允許去除。 《實驗動物管理條例》 清潔級或清潔級以上 動物合格證號及動物實驗室合格證號 大鼠： 10 ml/kg?BW（若以水為溶劑，推薦 20 ml/kg?BW） 小鼠： 20ml/kg?BW 樣品的預處理原則 應選擇適合于受試動物的溶劑、乳化劑、助懸劑，要求無毒、與受試物不發(fā)生反應、穩(wěn)定性好。使 ? 用說明書等有關資料 ? 受試物應符合既定配方和生產(chǎn)工藝的規(guī)格化產(chǎn)品 實驗動物的選擇及給樣量 ，合理選擇實驗動物 常用大鼠和小鼠，品系不限，推薦使用近交系。 （ 1）有營養(yǎng)價值：按設計量進行飼料的營養(yǎng)成份調(diào)整，提供詳細的說明。 急性經(jīng)口毒性試驗 時間周期 ：一般為 3周 35天，大、小鼠適應期 714天，染毒及實驗觀察期 發(fā)生動物死亡時，應進行大體解剖 觀察和評價指標 ： 毒性反應癥狀：各器官系統(tǒng)的異常表現(xiàn)（中樞、自主神經(jīng)、呼吸、心血管、胃腸、生殖泌尿系統(tǒng)、皮毛、粘膜等）及體重變化 死亡情況：死亡的時間、數(shù)量、性別、表現(xiàn)等。 鼠傷寒沙門氏菌（ Ames）試驗 觀察及評價指標： 各受試物組及三個對照組的四種菌株（ TA97a， TA98，TA100和 TA102）分別在加和不加 S9情況下的菌落計數(shù)。當受試物的 LD50≥10g/ 時，最高劑量通常采用 10g/。在顯微鏡下便可觀察染色體數(shù)目和形態(tài)。因此形態(tài)的改變提示有關基因及其蛋白產(chǎn)物的改變。 結果評價 ： 受試物組與對照組的斷片、易位、畸變細胞率、常染色體單價體、性染色體單價體等差異有統(tǒng)計學意義，試驗結果為陽性。高劑量應能引起動物明顯毒效應但不造成動物死亡。 病理檢查 ：大體解剖、臟器稱重、組織病理學檢查。在 100倍至 300倍之間需進行慢性毒性試驗，小于 100倍需放棄。 應綜合考慮的問題 在分析試驗組與對照組指標統(tǒng)計學的顯著性時，應根據(jù)其有無劑量反應關系及與本實驗室的歷史性對照值范圍比較的原則 ,來綜合考慮指標差異有無生物學意義。 應綜合考慮的問題 在評價保健食品的安全性時，應盡可能收集人群食用受試物后反應的資料。 審評結論的判定 ，大會再審，屬以下幾種情況之一： （ 1）由于實驗操作不規(guī)范，根據(jù)提供的檢驗報告無法評價產(chǎn)品的安全性，需要做除 30天 /90天喂養(yǎng)試驗以外的毒理學試驗； （ 2）已有數(shù)據(jù)提示可能存在安全性問題，但難以下結論，需要重復試驗。 國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家有關部門規(guī)定的不可用于保健食品以及禁止使用的物品，不得作為新原料。 新原料安全性毒理學試驗要求 毒理學試驗結果 ? 新原料的未觀察到有害作用劑量（ NOAEL）應大于或等于人群可能攝入量的 100倍； ? 如果人體推薦攝入量較大，試驗中可給予的最大劑量小于人群可能攝入量的 100倍，則在可給予的最大劑量下不應觀察到有害作用。 最典型的是人參 、 鹿茸 、 減肥產(chǎn)品 ， 并非受試物本身有毒影響了動物的生長發(fā)育 ， 而是因為這類產(chǎn)品的服用對象是成人 ， 所用的動物是離乳大鼠 。 ,結論是 ﹥ 10g/KgBW。 ：陽性對照組精子畸形率 ﹤ %，即判斷陰性對照組與陽性對照組相比差異有顯著性 P﹤ 。 177。 177。 ， 雌性大鼠 700多克 、 600多克 ， 而體重與食物利用率和以前的差不多 。 （具體方法同安全性毒理學評價） ? 處理方法需在試驗報告中詳細描述 ? 必須說明受試物濃縮或稀釋倍數(shù)、濃度，據(jù)此計算出的給予劑量 動物功能學試驗基本要求 、 受試物給予方式及時間 （ 1） 實驗動物： 性別 單一性別 年齡 依試驗要求進行選擇 數(shù)量 大鼠每組 812只 小鼠每組 1015只 其余要求同安全性毒理學評價要求 動物功能學試驗基本要求 （ 2）受試物給予方式： 必須經(jīng)口給予， 首選灌胃 ；若選擇飲水或摻入飼料， 最高劑量不超過 10％ ；提供每日每劑量組平均飲水量、食物攝入量及周食物利用率 （ 3）給樣時間： 根據(jù)具體功能主要指標而定， 7天 120天，一般為 30天。 （ 2） 人數(shù) 試食組和對照組的有效例數(shù)不少于 50人 ， 且試驗的脫離率一般不得超過 10%。 如果試驗在不同單位進行的 ， 必須提供同批號的受試樣品 。 （ 6） 改善生長發(fā)育和減肥功能的產(chǎn)品在人體功能試驗進行前需提供興奮劑檢測報告 。 各功能試驗審評要點 4. 提高缺氧耐受力功能檢驗方法 主要指標：常壓耐缺氧實驗 亞硝酸鈉中毒存活實驗 急性腦缺血性缺氧實驗 判定：三項試驗中任二項實驗結果陽性 。 注意事項： （ 1） 使用未批準用于食品的鈣的化合物 ， 除必做主要指標外 ， 還必須進行鈣吸收率的測定；使用屬營養(yǎng)強化劑范圍內(nèi)的鈣源及來自普通食品的鈣源可以不進行鈣的吸收率實驗 。 各功能試驗審評要點 2. 祛痤瘡功能試驗 受試對象：選擇臨床痤瘡 I－ III度的自愿健康受試者 ， 排除因病理性原因及妊娠及哺乳期婦女 。 ? 在試驗期間不得服用其它保持皮膚水分的物品及影響結果判定的化妝品 。 （ 2） 實驗開始前 ， 所選動物的血清總膽固醇一定要均衡 ， 喂飼高脂飼料后 ，總膽固醇與甘油三酯一定都要陽性 。 各功能試驗審評要點 動物實驗 主要指標：過氧化脂質(zhì)含量 （ MDA等 ） 抗氧化酶活性 （ SOD、 GSHPx） 判定：過氧化脂質(zhì)含量中任一指標和抗氧化酶活性中任一指標同為陽性 。 文化程度基本一致 ， 且未接受過類似測試 。 各功能試驗審評要點 動物實驗：大鼠棉球植入實驗或大鼠足趾腫脹實驗任選其一 主要指標：肉芽腫凈量 （ 棉球植入實驗 ） 致炎劑刺激前后足跖厚度差異 （ 足趾腫脹實驗 ） 判定：肉芽腫凈量或致炎劑刺激前后足跖厚度差異陽性 。 要求： （ 1） 受試者在試食觀察期間不該變原有抗高血壓藥物治療方案 。 要求：盡可能考慮如乳母年齡 、 嬰兒出生天數(shù) 、 飲食情況 、 家庭經(jīng)濟狀況等因素 ， 進行均衡性檢驗 。 替代主食的減肥功能食品 ， 可以不做動物實驗 ， 僅進行人體試食試驗 。 ③ 生化主要指標增做血尿酸 、 尿酮體主要指標 ， ④ 體內(nèi)脂肪總量和脂肪占體重百分率 ， 用水下稱重法或電阻抗法 。 （ 3） 受試物給予時間：不少于 3個月 ， 必要時延長至 6個月 。 （ 2） 于試驗開始前 、 結束前進行三天的詢問法膳食調(diào)查 ， 觀察飲 食因素對試驗結果的影響 。 要求：考慮年齡 、 性別 、 飲食情況等影響因素進行均衡性檢驗 。 排除其它疾病引起的消化不良者 、 急慢性腹瀉及糞便蟲卵陽性者 。 受試對象：選擇排便次數(shù)減少和糞便硬度增加 ， 大便一周少于 3次 ，無器質(zhì)性便秘者 。 要求：考慮年齡 、 性別 、 病程狀況 ， 進行均衡性