【正文】 ， 這是先設(shè)計(jì)再做試驗(yàn) ， 還是先做試驗(yàn)再設(shè)計(jì) ？ 18%， 袋泡茶摻入飼料給予動(dòng)物 。 177。 177。 （ 正?；温蕿?%） 。 24小時(shí) 。 存在的問(wèn)題 ? 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的選擇 1. 配方中含有僅限局部地區(qū)人群食用而又不在 “ 51號(hào) ”名單上的原料 ， 只對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了兩階段毒理試驗(yàn) ，而未對(duì)原料本身按要求進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià) ， 有的進(jìn)行了評(píng)價(jià)但給予動(dòng)物受試物的方式與實(shí)際食用方式不一樣 ， 如袋泡茶摻在飼料中給予動(dòng)物 。 第四部分 保健食品安全性毒理學(xué) 評(píng)價(jià)中存在的問(wèn)題 存在的問(wèn)題 鑒于制訂此程序的歷史背景與目前情況有所不同 ， 因此 ， 對(duì)保健食品的安全性評(píng)價(jià)時(shí) ， 出現(xiàn)了選擇毒理試驗(yàn)的項(xiàng)目 、 劑量 、 樣品前處理等問(wèn)題 ， 現(xiàn)就上述問(wèn)題一并提出供討論 。 保健食品新原料定義 在已批準(zhǔn)的保健食品中使用過(guò)，或衛(wèi)生部已批準(zhǔn)為新資源食品的原料，符合以下情況的仍按新原料進(jìn)行管理： ?未列入國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品的物品名單； ?尚未列入衛(wèi)生部公布或批準(zhǔn)的食品新資源或新資源食品名單內(nèi)； ?衛(wèi)生部已批準(zhǔn)為食品新資源或新資源食品，但保健食品注冊(cè)申請(qǐng)人與食品新資源或新資源食品生產(chǎn)批件中載明的申報(bào)單位不一致。 （ 1）毒理學(xué)評(píng)價(jià)的結(jié)果表明產(chǎn)品在推薦劑量下對(duì)人體具有一定的毒性，存在安全性問(wèn)題。 在對(duì)保健食品進(jìn)行最后評(píng)價(jià)時(shí)，必須綜合考慮受試物的原料來(lái)源、理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點(diǎn)、蓄積性、接觸的人群范圍、食品中的使用范圍、人的可能攝入量及保健功能等因素，確保其對(duì)人體健康的安全性。 對(duì)實(shí)驗(yàn)中某些指標(biāo)的異常改變，在結(jié)果分析時(shí)要注意區(qū)分是生理學(xué)表現(xiàn)還是受試物的毒性作用。 其它試驗(yàn)結(jié)果判斷 ? 慢性毒性試驗(yàn) ： 以 LD50或 30天喂養(yǎng)試驗(yàn)的最大未觀察到有害作用劑量設(shè)計(jì)受試物各劑量組，未見(jiàn)有毒性作用。 30天喂養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果的判定 ： 對(duì)于只要求進(jìn)行一、二階段試驗(yàn)者，最大未觀察到有害作用劑量 ≥ 人可能攝入量的 100倍，綜合其它試驗(yàn)結(jié)果可初步做出安全性評(píng)價(jià)。低劑量應(yīng)不出現(xiàn)任何毒作用，同時(shí)在這二劑量之間設(shè)幾個(gè)中間劑量組。 遺傳毒性試驗(yàn)組合 試驗(yàn)結(jié)果的判定 ： 如三項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)（ Ames試驗(yàn)，微核或骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，精子畸形或睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)）中，體外或體內(nèi)有一項(xiàng)或以上陽(yáng)性，一般應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。 小鼠精子畸形試驗(yàn) 時(shí)間周期 ：一般為 7周 35天適應(yīng)期 小鼠經(jīng)口連續(xù)染毒 5天，于首次給樣后的 35天處死動(dòng)物 取兩側(cè)附睪，收集精子，滴片，染色，鏡檢 劑量設(shè)計(jì) ：同骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 小鼠精子畸形試驗(yàn) 觀察及評(píng)價(jià)指標(biāo) ： 每只動(dòng)物檢查 1000個(gè)精子 ，記錄精子畸形數(shù)目及類型。 哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 時(shí)間周期 ：一般為 3周 35天適應(yīng)期 小鼠或大鼠經(jīng)口染毒 24次，每次間隔 24h，在末次染毒 1824h進(jìn)行取材（取材前 24h，腹腔注射秋水仙素）。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。 結(jié)果評(píng)價(jià)（摻入法）： 受試物組回變菌落數(shù)增加一倍以上（即回變菌落數(shù)≥2 未處理對(duì)照組數(shù)），并有劑量反應(yīng)關(guān)系或有可重復(fù)的陽(yáng)性反應(yīng)，即可判試驗(yàn)陽(yáng)性。 大體尸檢結(jié)果：如果發(fā)生死亡動(dòng)物 急性毒性（ LD50）劑量分級(jí)表 級(jí) 別 大鼠口服 LD50， mg/kg 相當(dāng)于人的致死量 mg/kg g/人 極毒 1 稍嘗 劇毒 150 5004000 中等毒 51500 400030000 5 低毒 5015000 30000250000 50 實(shí)際無(wú)毒 500115000 250000500000 500 無(wú)毒 15000 500000 2500 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果的判定： 1. LD50＜人可能攝入量的 100倍，放棄；反之繼續(xù)下一步試驗(yàn)。 （ 2）大豆蛋白、乳清蛋白 如質(zhì)量、工藝等符合食品標(biāo)準(zhǔn)和安全要求，允許去除。 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》 清潔級(jí)或清潔級(jí)以上 動(dòng)物合格證號(hào)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào) 大鼠： 10 ml/kg?BW（若以水為溶劑，推薦 20 ml/kg?BW） 小鼠： 20ml/kg?BW 樣品的預(yù)處理原則 應(yīng)選擇適合于受試動(dòng)物的溶劑、乳化劑、助懸劑，要求無(wú)毒、與受試物不發(fā)生反應(yīng)、穩(wěn)定性好。使 ? 用說(shuō)明書(shū)等有關(guān)資料 ? 受試物應(yīng)符合既定配方和生產(chǎn)工藝的規(guī)格化產(chǎn)品 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及給樣量 ，合理選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 常用大鼠和小鼠，品系不限，推薦使用近交系。 （ 1）有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值：按設(shè)計(jì)量進(jìn)行飼料的營(yíng)養(yǎng)成份調(diào)整，提供詳細(xì)的說(shuō)明。 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 時(shí)間周期 ：一般為 3周 35天，大、小鼠適應(yīng)期 714天，染毒及實(shí)驗(yàn)觀察期 發(fā)生動(dòng)物死亡時(shí)，應(yīng)進(jìn)行大體解剖 觀察和評(píng)價(jià)指標(biāo) ： 毒性反應(yīng)癥狀：各器官系統(tǒng)的異常表現(xiàn)（中樞、自主神經(jīng)、呼吸、心血管、胃腸、生殖泌尿系統(tǒng)、皮毛、粘膜等）及體重變化 死亡情況：死亡的時(shí)間、數(shù)量、性別、表現(xiàn)等。 鼠傷寒沙門氏菌（ Ames）試驗(yàn) 觀察及評(píng)價(jià)指標(biāo)： 各受試物組及三個(gè)對(duì)照組的四種菌株（ TA97a， TA98，TA100和 TA102）分別在加和不加 S9情況下的菌落計(jì)數(shù)。當(dāng)受試物的 LD50≥10g/ 時(shí)，最高劑量通常采用 10g/。在顯微鏡下便可觀察染色體數(shù)目和形態(tài)。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白產(chǎn)物的改變。 結(jié)果評(píng)價(jià) ： 受試物組與對(duì)照組的斷片、易位、畸變細(xì)胞率、常染色體單價(jià)體、性染色體單價(jià)體等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。高劑量應(yīng)能引起動(dòng)物明顯毒效應(yīng)但不造成動(dòng)物死亡。 病理檢查 ：大體解剖、臟器稱重、組織病理學(xué)檢查。在 100倍至 300倍之間需進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)，小于 100倍需放棄。 應(yīng)綜合考慮的問(wèn)題 在分析試驗(yàn)組與對(duì)照組指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性時(shí)，應(yīng)根據(jù)其有無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系及與本實(shí)驗(yàn)室的歷史性對(duì)照值范圍比較的原則 ,來(lái)綜合考慮指標(biāo)差異有無(wú)生物學(xué)意義。 應(yīng)綜合考慮的問(wèn)題 在評(píng)價(jià)保健食品的安全性時(shí)，應(yīng)盡可能收集人群食用受試物后反應(yīng)的資料。 審評(píng)結(jié)論的判定 ，大會(huì)再審，屬以下幾種情況之一： （ 1）由于實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，根據(jù)提供的檢驗(yàn)報(bào)告無(wú)法評(píng)價(jià)產(chǎn)品的安全性，需要做除 30天 /90天喂養(yǎng)試驗(yàn)以外的毒理學(xué)試驗(yàn)； （ 2）已有數(shù)據(jù)提示可能存在安全性問(wèn)題，但難以下結(jié)論，需要重復(fù)試驗(yàn)。 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局和國(guó)家有關(guān)部門規(guī)定的不可用于保健食品以及禁止使用的物品，不得作為新原料。 新原料安全性毒理學(xué)試驗(yàn)要求 毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 ? 新原料的未觀察到有害作用劑量（ NOAEL）應(yīng)大于或等于人群可能攝入量的 100倍； ? 如果人體推薦攝入量較大，試驗(yàn)中可給予的最大劑量小于人群可能攝入量的 100倍，則在可給予的最大劑量下不應(yīng)觀察到有害作用。 最典型的是人參 、 鹿茸 、 減肥產(chǎn)品 ， 并非受試物本身有毒影響了動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育 ， 而是因?yàn)檫@類產(chǎn)品的服用對(duì)象是成人 ， 所用的動(dòng)物是離乳大鼠 。 ,結(jié)論是 ﹥ 10g/KgBW。 ：陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率 ﹤ %，即判斷陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異有顯著性 P﹤ 。 177。 177。 ， 雌性大鼠 700多克 、 600多克 ， 而體重與食物利用率和以前的差不多 。 （具體方法同安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)） ? 處理方法需在試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)描述 ? 必須說(shuō)明受試物濃縮或稀釋倍數(shù)、濃度，據(jù)此計(jì)算出的給予劑量 動(dòng)物功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 、 受試物給予方式及時(shí)間 （ 1） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 性別 單一性別 年齡 依試驗(yàn)要求進(jìn)行選擇 數(shù)量 大鼠每組 812只 小鼠每組 1015只 其余要求同安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)要求 動(dòng)物功能學(xué)試驗(yàn)基本要求 （ 2）受試物給予方式： 必須經(jīng)口給予， 首選灌胃 ；若選擇飲水或摻入飼料， 最高劑量不超過(guò) 10％ ；提供每日每劑量組平均飲水量、食物攝入量及周食物利用率 （ 3）給樣時(shí)間： 根據(jù)具體功能主要指標(biāo)而定， 7天 120天，一般為 30天。 （ 2） 人數(shù) 試食組和對(duì)照組的有效例數(shù)不少于 50人 ， 且試驗(yàn)的脫離率一般不得超過(guò) 10%。 如果試驗(yàn)在不同單位進(jìn)行的 ， 必須提供同批號(hào)的受試樣品 。 （ 6） 改善生長(zhǎng)發(fā)育和減肥功能的產(chǎn)品在人體功能試驗(yàn)進(jìn)行前需提供興奮劑檢測(cè)報(bào)告 。 各功能試驗(yàn)審評(píng)要點(diǎn) 4. 提高缺氧耐受力功能檢驗(yàn)方法 主要指標(biāo)：常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn) 急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn) 判定：三項(xiàng)試驗(yàn)中任二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性 。 注意事項(xiàng)： （ 1） 使用未批準(zhǔn)用于食品的鈣的化合物 ， 除必做主要指標(biāo)外 ， 還必須進(jìn)行鈣吸收率的測(cè)定；使用屬營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑范圍內(nèi)的鈣源及來(lái)自普通食品的鈣源可以不進(jìn)行鈣的吸收率實(shí)驗(yàn) 。 各功能試驗(yàn)審評(píng)要點(diǎn) 2. 祛痤瘡功能試驗(yàn) 受試對(duì)象：選擇臨床痤瘡 I－ III度的自愿健康受試者 ， 排除因病理性原因及妊娠及哺乳期婦女 。 ? 在試驗(yàn)期間不得服用其它保持皮膚水分的物品及影響結(jié)果判定的化妝品 。 （ 2） 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前 ， 所選動(dòng)物的血清總膽固醇一定要均衡 ， 喂飼高脂飼料后 ，總膽固醇與甘油三酯一定都要陽(yáng)性 。 各功能試驗(yàn)審評(píng)要點(diǎn) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 主要指標(biāo)：過(guò)氧化脂質(zhì)含量 （ MDA等 ） 抗氧化酶活性 （ SOD、 GSHPx） 判定：過(guò)氧化脂質(zhì)含量中任一指標(biāo)和抗氧化酶活性中任一指標(biāo)同為陽(yáng)性 。 文化程度基本一致 ， 且未接受過(guò)類似測(cè)試 。 各功能試驗(yàn)審評(píng)要點(diǎn) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)或大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)任選其一 主要指標(biāo)：肉芽腫凈量 （ 棉球植入實(shí)驗(yàn) ） 致炎劑刺激前后足跖厚度差異 （ 足趾腫脹實(shí)驗(yàn) ） 判定：肉芽腫凈量或致炎劑刺激前后足跖厚度差異陽(yáng)性 。 要求： （ 1） 受試者在試食觀察期間不該變?cè)锌垢哐獕核幬镏委煼桨?。 要求：盡可能考慮如乳母年齡 、 嬰兒出生天數(shù) 、 飲食情況 、 家庭經(jīng)濟(jì)狀況等因素 ， 進(jìn)行均衡性檢驗(yàn) 。 替代主食的減肥功能食品 ， 可以不做動(dòng)物實(shí)驗(yàn) ， 僅進(jìn)行人體試食試驗(yàn) 。 ③ 生化主要指標(biāo)增做血尿酸 、 尿酮體主要指標(biāo) ， ④ 體內(nèi)脂肪總量和脂肪占體重百分率 ， 用水下稱重法或電阻抗法 。 （ 3） 受試物給予時(shí)間：不少于 3個(gè)月 ， 必要時(shí)延長(zhǎng)至 6個(gè)月 。 （ 2） 于試驗(yàn)開(kāi)始前 、 結(jié)束前進(jìn)行三天的詢問(wèn)法膳食調(diào)查 ， 觀察飲 食因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響 。 要求：考慮年齡 、 性別 、 飲食情況等影響因素進(jìn)行均衡性檢驗(yàn) 。 排除其它疾病引起的消化不良者 、 急慢性腹瀉及糞便蟲(chóng)卵陽(yáng)性者 。 受試對(duì)象：選擇排便次數(shù)減少和糞便硬度增加 ， 大便一周少于 3次 ，無(wú)器質(zhì)性便秘者 。 要求：考慮年齡 、 性別 、 病程狀況 ， 進(jìn)行均衡性