【正文】 診斷，也可用于治療效果監(jiān)控。 ? PCR 142 bp ? BcLI ? ? 142bp 99 bp 43bp ? 電泳 ? 結(jié)果分析 ? ？ p1 p2 142bp 99bp 43bp Bcl I Bcl I Bcl I + 3/20/2023 22 問 :1/ Ⅱ Ⅲ 1診斷； 2/ Ⅲ 1是男或是女發(fā)病？ ? ? 142bp 99bp 1 2 1 2 3 Ⅰ Ⅱ III 1 3/20/2023 23 結(jié)果分析 ? 1）先癥者 II2具有 99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。血友病是一種遺傳性凝血障礙疾病，患者可能因很小的傷口而出血不止導(dǎo)致死亡。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。 3/20/2023 15 （二）通過連鎖遺傳標(biāo)志檢測(cè)診斷疾病 Diagnosis via linkage geic marker 基因結(jié)構(gòu)、突變情況不清楚，但已知定位在染色體的特定位置上。 BMD臨床癥狀與 DMD相似，但癥狀較輕。 Detection objects are products of genes , such as protein, polypeptide 3/20/2023 5 二 、基因診斷常用的技術(shù) ： Technologies in mon use (Nucleic acid molecular hybridization ) (PolymeraseChainReaction) 3. 以上二者的衍生技術(shù)（包括 DNA芯片 ） derivative technologies from above two technologies, DNAChips 4. DNA序列測(cè)定 DNA sequencing 3/20/2023 6 基因診斷獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)： Advantages of gene therapy ?從分子水平上找到特異的致病基因 To find pathogenic genes at the molecular levels ?具有很高的靈敏度 High sensitivity 3/20/2023 7 ? 獲得穩(wěn)定的結(jié)果 Stable Results 核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定 Nucleic acid is more stable than that of protein. ? 快速、早期診斷技術(shù) Speedy early 甚至在未出現(xiàn)癥狀的情況下早期診斷 ? 應(yīng)用廣、適用性強(qiáng) Wide applicability 3/20/2023 8 三、基因診斷策略 Strategies for gene therapy （一）通過致病基因的檢測(cè)診斷疾病 Diagnosis of diseases via pathogenic genes 3/20/2023 9 基因的結(jié)構(gòu)清楚、突變點(diǎn)明確 、致病機(jī)制基本清楚?；蛟\斷與基因治療 Gene Diagnosis and Gene Therapy Laboratory of Molecular Virology, Institute of Virology, Wuhan University School of Medicine 3/20/2023 1 第一節(jié) 基因診斷 （ gene diagnosis） 一、定義： Definition of gene diagnosis 基因診斷：用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)導(dǎo)致疾病的原因進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測(cè)分析 ,從而對(duì)相應(yīng)疾病進(jìn)行診斷。 Structure, mutation and pathogenic mechanism of pathogenic genes are clearly understood . 3/20/2023 10 3/20/2023 11 1)單基因遺傳病 eg. monogeic or singlegene disease 鐮狀細(xì)胞貧血 Sickle cell anemia → 珠蛋白基因 globin gene Codon 6 GAG→ GTG AT突變 (mutation) 谷氨酸 (glutamic) → 纈氨酸 (valine) 3/20/2023 12 2)、 Gene 缺失遺傳病的診斷 1)α 地貧的 Gene診斷 ? α 基因不同程度的缺失引起不同類型的 α 地貧， α 基因缺失 1～ 4個(gè)。 ? Gene 定位 Xp21 ， Gene 2300kb,79 個(gè)Exon ， cDNA全長 13974bp 編碼 3685 Aa，分子量 427kD。 Chromosome location of pathologic genes is clear, but the structure and mutation of the genes are unclear. 3/20/2023 16 同一染色體上位置十分靠近的基因或其他遺傳標(biāo)志 ,常常一起遺傳 ,形成 連鎖（ linkage） . The genes or other geic markers located near at the same chromosome can be inherited together, and to form linkage. 3/20/2023 17 例如：具體基因不明的遺傳病 Hereditary disease caused by unidentified genes 用 內(nèi)切 酶切正常母親 DNA，雜交后出現(xiàn)；同酶同方法檢查有遺傳病的父親，發(fā)現(xiàn) ，表明 因病有連鎖關(guān)系。 ? APKD——Gene定位 16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí) APKD Gene與 α珠蛋白基因 3`端附近的一段小衛(wèi)星 DNA序列（ 3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過 RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。血友病在女性一般表現(xiàn)為隱性遺傳，較少發(fā)病，但會(huì)傳給后代；在男性則表現(xiàn)為顯性遺傳，顯示出病癥。 ? 2） II2有 142bp/99bp雜合子。 Application of realtime polymerase chain reaction to gene diagnosis and monitoring oute of therapy 3/20/2023 30 3/20/2023 31 四、基因診斷存在的問題及前景 Problems and prospects in the gene diagnosis 理論問題 theory problems . 3/20/2023 32 已找到的致病基因不多，弄清機(jī)制的就更少。 ? The variety and plexity of technology has also grown and we need a profession that deals with this situation 3/20/2023 35 ? 技術(shù)靈敏度高，很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。 ? The mutation in CGG repeat of FMR1 gene leads to altered function. 3/20/2023 46 ? 可通過檢測(cè)串聯(lián)重復(fù)序列的長度來進(jìn)行。 Therapeutic effect of expression products of genes of interest on diseases. 3/20/2023 61 現(xiàn)在 :將正?；?qū)氩∽兗?xì)胞中，替代或與缺陷基因共存，產(chǎn)生正常表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)充缺陷蛋白質(zhì) Deliver normal copy of a gene into pathological cells to supplement the protein that are not expressing enough. 3/20/2023 62 ? 抑制細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的基因； Deliver nucleic acid that will inactivate an overexpressed deleterious protein. 3/20/2023 63 ? 將特定基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定產(chǎn)物； and transfer given gene into normal cells to let it express given gene products. 3/20/2023 64 ? 向功能異常細(xì)胞中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來不存在的基因，利用表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。 3/20/2023 79 1） 基因修飾腫瘤細(xì)胞的“疫苗”療法 ：將 ILTNF導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，誘發(fā)抗腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)；另分泌的細(xì)胞因子增強(qiáng) CTL和效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)。nude39。 It is the key structure for the integration of viral genome into the chromosome of host cells, forming the provirus. 3/20/2023 95 2）有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因 : gag、 plo和 env It contains 3 structure genes, gag, plo and env 分別編碼核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和外殼（包膜）糖蛋白 ,encoding core protein, reverse transcriptase and envelope glycoprotein, respectively. 3/20/2023 96 3/20/2023 97 ? 3） 5‘端 LTR下游有病毒包裝所必需的序列、引物結(jié)合位點(diǎn)等。 Liposome, positively charged lipid droplets, can interact with negatively charged foreign DNA to wrap it up and deliver to cells via endocytosis. 3/20/2023 108 Gene transfer via cell surface receptors 受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用是轉(zhuǎn)移特異性外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的一種方式。 Coupling can be realized by condensed cation, such as polylysine 3/20/2023 113 ? 如：僅在肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白（ ASGP）受體，它的天然配體是 ASGP。 The effect of repeated injection is more effective than that of single injection. 3/20/2023 116 3/20/2023 117 優(yōu)點(diǎn)： Advantages ? 制備簡(jiǎn)單 easy to handle ? 排除病毒致癌的潛在危險(xiǎn) without carcinogenic risk of virus 3/20/2023 118 ? 不需整合即可表達(dá) expression without needing integration ? 可反復(fù)使用 and can be administered again and again. 3/20/2023 119 三、基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞 Target cells used in gene transfer ? 目前條件下，基因治療僅限于體細(xì)胞（嚴(yán)禁進(jìn)行生殖細(xì)胞的基因治療操作） ? All current human gene therapy approaches are targeted to somatic cells not germline cells. 3/20/2023 120 3/20/2023 121 ?