【正文】 關種間 SSR... 基因重組的熱點，是基因變異的來源；216。SSR的主要功能 :　216。l通過對 54個植物種核 DNA和 28個植物種細胞器DNA SSR(14bp)的搜索 ,發(fā)現(xiàn)：l (AT)ｎ 最豐富 ,然后依次是 : (A)n、 (T)n、 (AG)n、(CT)n、 (AAT)n、 (ATT)n、 (AAC)n、 (GTT)n、 (AGC)n、 (GCT)n、 (AAG)n、 (CTT) n、 (AATT)n、 (TTAA)n、(AAAT)n、 (ATTT)n及 (AC)n、 (GT)n。植物中平均 SSR。ISSRl 共同優(yōu)點： 在不需要知道所擴增 DNA序列情況下，產(chǎn)生 DNA片段的指紋； 需 DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。? 不同物種間引物通用； 45秒Step515秒Step3l， 再加入石臘油，進行 PCR擴增Step1Mg2+（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。Primer 15ngDNA（ 20ng/181。339。339。539。Klenow酶n 加水至 50ul， 37℃ 溫箱中標記 2小時RFLP標記 特點l共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型l穩(wěn)定、重復性強l某些植物中開發(fā)探針已遍及整個基因組l缺點： DNA需要量較大，技術復雜； 用于做圖較費時，難以分析大量樣品 ； 在基因組較大、嚴格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低。寡聚核苷酸n 2ul使用磷屏儀，操作更方便。于暗室中將 封好雜交盒后，置65℃ 溫箱中振蕩過夜。冼膠，風干酶切 — 電泳 — 印跡— 雜交 — 洗脫n 預雜交：將雜交膜放人預雜交液（水、 5HClDNA， 以 10U內(nèi)切酶酶切 5小時 Fragment—SimplePolymorphicLength分子標記的分類（ Staub等 1996）分子標記以 Southern為基礎如 RFLP以 PCR為基礎單引物 PCR標記 有 RAPD、 APPCR、 DAF、 ISSR等雙引物選擇性擴增 PCR 主要指 AFLP需克隆、測序構建特殊雙引物 PCR標記如 SSR、 STS等植物遺傳研究中常用的分子標記n RFLP 分子標記及其在植物遺傳育種中的應用遺傳標記（ geic marker）具有多型性易于鑒別與目標基因緊密連鎖 ? 性狀標記 色澤， 形態(tài) …? 細胞學標記 倒位，易位， G/N/C帶 …? 生化標記 同功酶 …? 分子標記 RFLP、 RAPD、 SSR、 AFLP、 SNP… …基礎基礎 基因表達基因表達結果結果表現(xiàn)型表現(xiàn)型DNA堿基堿基序列變異序列變異形態(tài)標記n 遺傳學上穩(wěn)定、可見的外部特征遺傳與環(huán)境、結構基因與調(diào)控基因綜合作用的結果。細胞學標記n 染色體數(shù)目變異及結構變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等）和帶型（ C帶、 N帶、 G帶等）。生化標記 —— 貯藏蛋白和同工酶n 貯藏蛋白n 同工酶n 特點：經(jīng)濟、方便、成本較低n 結構基因表達產(chǎn)物，對非結構基因無能為力；所檢測位點只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時受發(fā)育時期和環(huán)境影響?！狿olymorphismDNAsSequenceLengthDNA限制性內(nèi)切酶酶切n 電泳： %瓊脂糖膠 70V電泳 16小時 20分鐘，抽真空，水冼n 印跡：加入 HSB、 DenhardtⅢ ） 中， n 洗脫：將膜轉入洗脫盒，加入洗脫液 65℃ X光片放于雜交膜上， RFLP探針探針標記 — 隨機引物法n 25BSAn 3ulRAPDn 原理：n 用一個隨機引物（ 810bp）、 堿基隨機排列的寡核苷酸序列，非定點地擴增基因組 DNA， 然后電泳分開擴增片段。 339。 539。 539。l） 1181。l） 95℃ 36℃ GOTO72℃ 5分鐘 v 缺點：大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；實驗重復性較差，結果可靠性較低。l 缺點：l 對反應條件非常敏感，重復性差。雙子葉植物 SSR數(shù)量大于單子葉植物 ,核 DNA SSR數(shù)量多于細胞質(zhì) DNA。l同一類內(nèi)堿基種類不同的 SSR,豐度差別很大。 編碼氨基酸；216。 部分 SSR可產(chǎn)生轉錄啟動復合物或活化染色體v 兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設計一對特異引物，通過 PCR將其間微衛(wèi)星序列擴增出來，利用電泳技術獲得長度多態(tài)性。...Crossspecies SSRTaxonomic Transferability Polymorphism Divergence % (N) % (N)Same subgenus (521) (299)Same genus (1800) (773)Same alliance (403) (141)Same family (1683) (363)SSR的操作PCR反應：DNA（ 20ng/181。l混合后，進行 PCR擴增 ：Step1 2分鐘Step2 30秒Step3 30秒Step4 60秒Step5 Step2SSR的特點：l 兩側順序保守，在同種間多相同；l 數(shù)量豐富，在整個基因組均勻隨機分布；l 實驗重復性好，結果可靠；l 多數(shù) SSR增減重復序列頻率高，在品種間具廣泛位點變異；l 共顯性標記，可鑒別雜合子和純合子；l 僅需微量組織，適合 PCR分析半自動化v 相對的物種專一性；v 由于開發(fā)時需針對每個座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設計引物，需建立基因文庫、克隆識別與篩選、測序等過程，開發(fā)困難，費用較高，耗時長；v 實際分析時一般每次只分析單個位點；v 不同引物退火溫度不同，需要探索。；P00:539。MseIprimers +3: 539。（ 2）多態(tài)性遠遠超過其它分子標記，一般可檢測到 50100個 AFLP擴增產(chǎn)物，能夠在遺傳關系十分相近的材料產(chǎn)生多態(tài)性，被認為是指紋圖譜技術中多態(tài)性最豐富的一項技術。 DNA）， 而且對模板濃度的變化不敏感。AFLP操作具體包括三個步驟：1.對于基因組較大的物種，需要進行兩步擴增 —預擴增和選擇性擴增。PstⅠ pmol/181。接頭（ 5 ATP（ 10mM） T4連接酶（ 3U/181。 加水至 25181。引物（ P00， 50ng/181。l） 加 ddH2O至 20181。cyclesl稀釋預擴增液，加入 16181。10PCRMg2+（ 30mM） Step1 95℃ 2分鐘Step5 GOTOStep8 72℃ 60秒 熒光216。3．酶切 連接反應可以分開作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。一般而言，Ｇ和Ｃ含量越高，擴增出的產(chǎn)物數(shù)目越少。matching(1945)相似系數(shù) ， 即 (1979)相似系數(shù) .其中 n 根據(jù)遺傳特性確定的羅杰斯距離在相關種質(zhì)的親緣關系分析中非常有用；而改良的羅杰斯距離還適用于雜種優(yōu)勢研究。 特點：n 雙等位基因n 在基因組中的發(fā)生頻率比較高n 有些 SNP位點還影響基因的功能 優(yōu)點：密度高、制作方便，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量等不足DNA微陣列（ Microarray）微型化高通量 — 提高信息量平行化 — 提高信息的可比性微量化 — 降低待檢樣品用量自動化 — 提高工作效率低成本 — 可迅速普及推廣生物芯片的特征與優(yōu)點蛋白質(zhì)組學為基礎的分子標記n 蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物 ,是基因功能的執(zhí)行體，決定了生物的生長、發(fā)育、繁殖等各種性狀。geln 經(jīng)典遺傳圖譜：形態(tài)、生理和生化標記，數(shù)量極為有限，圖譜分辨率大都很低，表現(xiàn)標記少，圖距大，飽和度低。markerfrequencyaslinkagedens