基于脂蛋白納米載體的小干擾rna靶向遞送方法研究畢業(yè)論文-wenkub
2023-07-10 00:50:50 本頁面
【正文】 細胞多余膽固醇返回到肝臟進行消除（膽汁排泄或在肝腸循環(huán)使用）。基于體積小，屏蔽疏水核心，受體介導的攝取能力等這些有效特征，HDL納米粒是一種理想的藥物載體。 為了研究siRNA靶向輸送途徑，一些腫瘤細胞受體已被獲知。例如，乳腺癌細胞通過增加SR B1的表達來增加膽固醇酯的攝取。激活STAT3是惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和發(fā)展（例如，細胞增殖，分化和存活）的關鍵過程。在卵巢癌患者中， FAK過度表達與侵襲性腫瘤的特征相關，這有助于弱勢細胞生存。簡單地說，載脂蛋白AI ，是rHDL納米粒的主要核蛋白，在生產(chǎn)蛋白過程中用質(zhì)粒載體進行分離和純化。膽酸鈉，140μL （ 100mg/ml溶于為PBS ）形成的蛋黃卵磷脂摩和膽酸的摩爾比為1: 。rHDL/ ％。顆粒明顯可見（放大50000倍），通過使用Zeiss 910透射型電子顯微鏡。本篇文章中所用到所有細胞株都是德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的，通過表征細胞線芯的研究得到認證。所有的細胞都保存在37176。 ） ，粘著斑激酶（靶序列539。 ）均購自SigmaAldrich公司 ，RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑按照廠家建議使用。RNA通過提取(氯仿),沉淀(異丙醇)和純化(75%乙醇)。從微序列分析得到的基因表達數(shù)據(jù)，加載到異丙醇獨創(chuàng)性通路數(shù)據(jù)庫，關于凋亡基因的不同表達可以驗證選擇性。肌動蛋白作為一個內(nèi)源性對照。C孵育過夜。流式細胞儀分析之前的樣品。高表達或低表達都是由婦科病理學家使用下列程序來決定的:強度從1到3,分布是從1到4。siRNA選擇性遞送 （每組n = 3時）靜脈注射或腹腔注射 。每張幻燈片有十個高倍區(qū)域，取平均值。適合的腫瘤細胞來源于卵巢癌小鼠模型（ HeyA8，SKOV3ip1和HeyA8 MDR ）用腹腔注射接種。兩個星期后，按照前面描述的開始用奧沙利鉑處理，根據(jù)圖2C所示。在非參數(shù)值中,連續(xù)變量使用曼懷氏等級和檢驗或秩和檢驗(所有組)進行比較。本研究中所有的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)分析。rHDL納米粒具有強大的有效載荷承載能力（最高至4mg siRNA /ml)。在50種人類卵巢上皮癌, 96%的腫瘤細胞表達了SRB1受體(圖1 C)。在正常的組織里，只有肝臟SRB1高度表達，而其他組織很少表達。我們進一步驗證rHDL納米粒的遞送是否由受體介導。用該方法進行長期治療實驗之前，我們下一個驗證STAT3 siRNA偶聯(lián)到rHDL納米顆粒(siRNA / rHDL)在體內(nèi)基因沉默的有效性。第四天，我們發(fā)現(xiàn)降低了88% STAT3蛋白水平(圖W3B)，在第6天，蛋白表達有些回升。Figure delivery of siRNA using rHDL nanoparticles. (A) Uptake of Alexa555labeled siRNA/rHDL in SKOV3ip1 tumors. A single IV or IP injection of mg/kg of Alexa555 labeled or mg/kg of IV and IP injection of untagged siRNA/rHDL was administered in mice bearing SKOV3ip1 tumors, and 48 hours later, tumors were harvested and counterstained with Hoechst (blue), and siRNA (red) uptake was assessed with fluorescence microscopy. The Hamp。在HeyA8 模型中，單獨給STAT3 siRNA / rHDL或多烯紫杉醇減少了的62%的腫瘤重量(P ,兩者)。(圖W4A) 考慮到STAT3的耐藥性，我們還進行了紫杉醇耐藥HeyA8MDR模型實驗(圖2 B)。腫瘤節(jié)數(shù)量也有類似的效果（圖2）。腫瘤細胞注射到脾臟后，轉(zhuǎn)移擴散到肝臟。與對照組相比，奧沙利鉑和STAT3 siRNA / rHDL偶聯(lián)治療可使腫瘤重量（ 96 ％，P ）和肝臟中轉(zhuǎn)移損壞數(shù)目（86％ ，P ）顯著減少。我們在SKOV3ip1原位卵巢癌模型中用FAK siRNA / rHDL 納米粒靶向FAK(圖2 C)?！TAT3靶向腫瘤微環(huán)境的影響 為了了解STAT3 / rHDL的生物效應，在藥物敏感的(SKOV3ip1)和藥物耐藥(HeyA8MDR)卵巢癌模型中進行一系列的體內(nèi)體外實驗。對照組比較，STAT3 siRNA / rHDL 和多烯紫杉醇偶聯(lián)治療可顯著降低細胞增殖(39%，P ）。同樣,在HeyA8MDR模型中，就多烯紫杉醇處理對MVD 的降低沒有影響，但多烯紫杉醇和 STAT3 siRNA / rHDL偶聯(lián)治療可顯著降低(圖W6)。與對照組(P )相比，STAT3 siRNA / rHDL 和多烯紫杉醇的聯(lián)合治療可增加30倍的腫瘤細胞凋亡。從表中知，我們使用RTPCR驗證STAT3基因沉默后最顯著改變的12個基因(圖4 C)。在HeyA8MDR模型中也有類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。與多烯紫杉醇治療相比，STAT3 siRNA可增高41%的細胞凋亡(P )，這表明在體內(nèi)凋亡效應的確實受到直接影響(圖5A)。生物效果是通過降低腫瘤細胞增殖，減少降低血管生成，降低細胞生存率來評估。因此,非特異性遞送系統(tǒng)可能需要更高的劑量來達到有效性和持續(xù)的基因沉默。我們的數(shù)據(jù)表明，與正常組織相比，SRB1受體在腫瘤細胞中的表達增加。此外,我們的安全研究表明，對照組siRNA相比，STAT3 / rHDL在小鼠肝臟中吸收沒有任何不良反應。即使STAT3被廣泛認為是一個重要的癌癥啟動子，傳統(tǒng)治療方法因其靶向性受到的限制。所以，藥理干預靶向STAT3對于這里描述的納米技術是可能的。FAK siRNA / rHDL 治療方法具有高度腫瘤特異性，可以顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移并且對其他器官無明顯副作用。Figure of SRB1 mRNA in different human organs and tumors using RTPCR. Actin is used as a loading control.Figure of systemic delivery of fluorescentlabeled siRNA/ control siRNA/rHDL or untagged siRNA/rHDL was injected (IV or IP), and 48 hours later, organs were harvested. Freshfrozen tissues were counterstained with Hoechst, and the level of fluorescentlabeled siRNA (red) was assessed with fluorescent microscopy. Average fluorescence uptake is represented by the graphs. *P .05 pared with untagged siRNA/rHDL. Ha
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