【正文】 氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹等16種抗菌藥的耐藥性。（五）菌株保藏與鑒定單位中監(jiān)所負責對各地耐藥性監(jiān)測實驗室分離的大腸桿菌和人畜共患病原菌（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和彎曲桿菌）菌種的保存，并指導各任務承擔單位進行沙門氏菌血清分型，承擔沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和彎曲桿菌罕見耐藥表型菌株的確認、收集和保存以及耐藥機制的鑒定。釅錒極額閉鎮(zhèn)檜豬訣錐顧葒鈀詢鱈驄。（二）中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（以下簡稱“中監(jiān)所”）負責全國動物源細菌耐藥性監(jiān)測的技術指導、數(shù)據(jù)庫建設與維護工作，藥敏試驗板的設計與質(zhì)量控制、監(jiān)測結(jié)果的匯總分析。監(jiān)測對象實行定點監(jiān)測與隨機監(jiān)測相結(jié)合的原則。2019年動物源細菌耐藥性監(jiān)測計劃根據(jù)《獸藥管理條例》規(guī)定，為做好2019年動物源細菌耐藥性監(jiān)測工作，充分發(fā)揮監(jiān)測工作的支撐作用，促進養(yǎng)殖環(huán)節(jié)科學合理用藥，制定本計劃。從2019年開始將“全國獸用抗菌藥使用減量化行動試點養(yǎng)殖場”（養(yǎng)殖場名錄見附件1）作為長期定點監(jiān)測場；除對長期定點監(jiān)測場進行跟蹤監(jiān)測外，每個監(jiān)測省份還須隨機監(jiān)測至少3個地市，每個地市隨機監(jiān)測至少3家養(yǎng)殖場或屠宰場開展監(jiān)測。殘騖樓諍錈瀨濟溆塹籟婭騍東戇鱉納。（四）監(jiān)測任務承擔單位農(nóng)業(yè)農(nóng)村部部屬有關單位，可承接政府購買服務的高等院校、科研院所、省級獸藥檢驗機構(gòu)和第三方檢測機構(gòu)等，共同承擔動物源細菌耐藥性監(jiān)測任務，負責實施耐藥性監(jiān)測工作。謀蕎摶篋飆鐸懟類蔣薔點鉍雜簍鰩驅(qū)。煢楨廣鰳鯡選塊網(wǎng)羈淚鍍齊鈞摟鰨饗。籟叢媽羥為贍僨蟶練淨櫧撻曉養(yǎng)鰲頓。滲釤嗆儼勻諤鱉調(diào)硯錦鋇絨鈔陘鰍陸。（三）采樣時應做好養(yǎng)殖場用藥情況和飼料來源調(diào)查，認真填寫《采樣記錄表》（見附件3）。（五）各任務承擔單位進行藥敏試驗時應使用經(jīng)過質(zhì)量認證的檢測板。六、結(jié)果報送（一）各監(jiān)測任務承擔單位登錄中國獸藥信息網(wǎng)（），在中國獸藥數(shù)據(jù)庫下選擇“獸藥耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)”，輸入本單位用戶名和密碼，上傳耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)，經(jīng)實驗室相關負責人審核通過后進入數(shù)據(jù)分析庫，并進行總結(jié)分析。蠟變黲癟報倀鉉錨鈰贅籜葦繯頹鯛潔。泄殖腔拭子或動物盲腸，牛奶大腸桿菌200株，腸球菌200株，沙門氏菌、金葡菌、彎曲桿菌各50株廣東養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，奶牛場3個，屠宰廠為雞、豬源樣品。泄殖腔拭子或動物盲腸，牛奶大腸桿菌200株，腸球菌200株，沙門氏菌、金葡菌、彎曲桿菌各50株湖南養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，奶牛場3個，屠宰廠為雞、豬源樣品。泄殖腔拭子或動物盲腸，牛奶沙門氏菌、金葡菌、彎曲桿菌各100株北京、山西及其他省份養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，屠宰廠為肉雞和豬源樣品。動物腸道或拭子魏氏梭菌100株青海、寧夏及其他省份養(yǎng)殖場或屠宰廠10個，屠宰廠為羊源樣品。泄殖腔拭子或動物盲腸大腸桿菌200株，腸球菌200株江蘇養(yǎng)殖場或屠宰廠10個屠宰廠為雞、豬源樣品。泄殖腔拭子或動物盲腸大腸桿菌200株，腸球菌200株注：總體采樣要求：根據(jù)采樣地區(qū)和不同動物盡量確保菌株數(shù)量均衡。采樣必須覆蓋農(nóng)業(yè)農(nóng)村部示范點。綾鏑鯛駕櫬鶘蹤韋轔糴飆鈧麥蹣鯢殘。（三）監(jiān)測細菌種類包括大腸桿菌、腸球菌（分為屎腸球菌和糞腸球菌）、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌（分為空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌）、魏氏梭菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、副豬嗜血桿菌等。鍬籟饗逕瑣筆襖鷗婭薔嗚訝擯饃鯫缽。構(gòu)氽頑黌碩飩薺齦話騖門戲鷯瀏鯪晝。結(jié)果報送各單位需在11月25日前完成動物源細菌耐藥性監(jiān)測年度總結(jié)，并將電子版總結(jié)報送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。采樣養(yǎng)殖場使用抗菌藥情況飼料來源與添加抗菌藥種類治療用抗菌藥種類與使用方式生產(chǎn)廠名稱飼料添加的藥物名稱劑量使用時間藥物名稱使用方式劑量 單個動物劑量飲水添加劑量 飼料添加劑量用藥天數(shù)樣品分離菌株□ 大腸桿菌□ 金黃色葡萄球菌□ 腸球菌□ 沙門氏菌□ 空腸彎曲桿菌其他__________________菌株編號：注：菌株編號按照“菌種、來源采樣地、采樣年月菌株編號”的格式進行。本方法適用于各種動物中大腸桿菌的分離與鑒定。1℃。 生化鑒定卡或商品化試紙條。3 培養(yǎng)基和試劑 運送培養(yǎng)基。動物肛門或泄殖腔拭子運送培養(yǎng)基接種于麥康凱瓊脂平板，36177。1℃培養(yǎng)18～24h； 挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，麥康凱瓊脂純化一代， 純化后可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板純化，36177。二、動物源沙門氏菌的分離與鑒定方法1范圍本方法規(guī)定了用于動物源沙門氏菌分離與鑒定的方法。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。 顯微鏡：10～100。 電泳儀。 小型離心管。 微波爐。加純凈水至 1000mL invA基因引物上游為5′GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA3′下游為5′TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C 3′ 運送培養(yǎng)基。 四硫磺酸鹽增菌液（TTB）。動物腸道或其他拭子運送培養(yǎng)基接種SC增菌液，36177。鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫搖飭緡釷鯉憮。碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞鷥膠據(jù)實鰹贏。1℃培養(yǎng)16～24h，待進一步細菌鑒定。必要時，用沙門氏菌標準血清進行血清型鑒定。 PCR反應體系的配制 根據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配制PCR反應體系，擴增片段長度約284 bp。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，TBE（或1TAE）緩沖液淹沒膠面。L上樣緩沖液混勻后加入加樣孔，每次電泳時，各做一個陽性對照和陰性對照。嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈癱懇跡見鮫請。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。 無菌離心管。5 操作步驟 采樣：到已選定的奶牛養(yǎng)殖場，現(xiàn)場采牛奶置入滅菌試管中，0℃～4℃保存，不超過48h。紂憂蔣氳頑薟驅(qū)藥憫騖覲僨鴛鋅鮚嗚。穎芻莖蛺餑億頓裊賠瀧漲負這惻鮭觶。 挑取可疑菌落。銚銻縵嚌鰻鴻鋟謎諏涼鏗穎報嚴鮑蠅。擠貼綬電麥結(jié)鈺贖嘵類羋罷鴇竇鮒鑿。 　 mL，放入小試管中，再加入BHI ～ mL，振蕩搖勻，置36℃177。塤礙籟饈決穩(wěn)賽釙冊庫麩適緄撾鲅傯。 采樣管 采樣棉拭子 生物安全柜 恒溫培養(yǎng)箱: 25℃177。 恒溫水浴鍋：37℃～100℃。：。結(jié)腸彎曲桿菌：上游：AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC，下游：TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC，擴增片段長度為364bp。1TAE緩沖液： 臨用時將50TAE緩沖液1份加蒸餾水49份，混勻即可。動物盲腸或者糞便拭子CCDA培養(yǎng)基42177。將上述接種后的平板置于42℃177。櫛緶歐鋤棗鈕種鵑瑤錟奧傴輥刪髖綠。（PCR）鑒定，12000r/min離心2min，棄上清。同時設立陰性和陽性對照。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。LPCR擴增產(chǎn)物和3181。 電泳條件電壓110V，電泳時間40min。五、動物源屎腸球菌和糞腸球菌的分離與鑒定方法1 范圍本方法規(guī)定了用于屎腸球菌和糞腸球菌分離與鑒定的方法。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。 生物安全柜。 吸頭（與微量加樣器匹配）。動物肛門或泄殖腔拭子運送培養(yǎng)基接種于腸球菌顯色瓊脂，36177。1℃培養(yǎng)18～24h； 挑取紅色至紫紅色的可疑菌落，顯色瓊脂上純化一代，36℃177。六、動物源魏氏梭菌分離與鑒定方法1 范圍 本方法規(guī)定了畜禽源魏氏梭菌（Clostridium perfringens）的分離與鑒定。 商品化細菌DNA提取試劑盒 質(zhì)控菌株：糞腸球菌 ATCC29212，金黃色葡萄球菌 ATCC29213 DNA Marker（2000bp） Taq DNA 聚合酶 dNTPs 瓊脂糖 50TAE緩沖液242g三羥甲基氨基甲烷（Tris）堿， EDTA()，加純水至1000mL稟虛嬪賑維嚌妝擴踴糶欏灣鯧飫驃餒。溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應釵藹紼較騮額。懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮揚銥鯊臘騖韋。（2）腸道內(nèi)容物：無菌剪開腸段，用接種環(huán)刮取內(nèi)容物， 放入含2mL FTG的5mL離心管中混勻，用石蠟封住液面，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h進行增菌。待瓊脂再次凝固后，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h。 魏氏梭菌鑒定從綿羊血瓊脂平板上任選5 個（小于5 個全選）有溶血環(huán)的菌落，分別接種到FTG 培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h。如果形態(tài)多樣，表明培養(yǎng)液不純，應劃線接種綿羊血瓊脂平板，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，挑取單個典型有溶血環(huán)的菌落接種到FTG 培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，做進一步純化。 ℃水浴中培養(yǎng)2 h 后，每小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，該現(xiàn)象的特點是乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì)，通常會上升到培養(yǎng)基表面。（1）硝酸鹽還原—動力試驗 用接種環(huán)（針）取FTG 培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力硝酸鹽培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h。15 min 內(nèi)出現(xiàn)紅色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許鋅粉，放置10 min，出現(xiàn)紅色者，表明該菌株不能還原硝酸鹽。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃，表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。攙閿頻嶸陣澇諗譴隴瀘鐙澮蹤島騁檻。夾覡閭輇駁檔驀遷錟減汆藥徑鴕駭槍。（4）電泳 反應結(jié)束后，%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為：電壓120V，電泳時間25min。緦徑銚膾齲轎級鏜撟廟耬癬紇徑驕鄰。本方法適用于副豬嗜血桿菌的分離與鑒定。1℃。buffer三羥甲基氨基甲烷（Tris） 醋酸 。榿貳軻謄壟該檻鯔塏賽緯闥糝鍔駕躦。嶁硤貪塒廩袞憫倉華糲饃勵騮詡駐賭。該櫟諼碼戇沖巋鳧薩錠謨贛贅眾騶嶠。取培養(yǎng)后的菌液1μL做PCR鑒定，陽性對照為副豬嗜血桿菌參考株SH0165。采取20 μL反應體系，組成成分見表52。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。L上樣緩沖液混勻后加入加樣孔，每次電泳時，各做一個陽性對照和陰性對照。如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與副豬嗜血桿菌陽性對照的條帶在一條直線上，即條帶與加樣孔的距離相同，而陰性對照無此條帶，則該樣品分離到的菌株可初步判定為副豬嗜血桿菌。再將分裝的菌進行逐級冷凍，先后置于4℃，20℃，80℃至少4h以上。本標準適用于膿汁中偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定2 設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下： 生物安全柜 冰箱：0 ℃ ~ 4 ℃ 和 20 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ 177。 溴化乙錠溶液（10㎎/ml）：稱取1 g溴化乙錠溶于100 ml水中，用磁力攪拌器攪拌數(shù)小時至完全溶解，避光冷藏（4 ℃）保存。 分離將新鮮的或運送培養(yǎng)基中的膿汁拭子在10％綿羊脫纖血瓊脂平板上涂抹，用經(jīng)火焰滅菌后冷卻的接種環(huán)劃線。 生化鑒定對于已純化的菌落，可使用細菌微量生化反應管進行生化鑒定，并對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行結(jié)果判定。 PCR反應體系根據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配置PCR反應體系。加熱熔化后倒入水平臺面的凝膠盤中，膠板厚約5 mm。紳藪瘡顴訝標販繯轅賽憮賄豎毆饉蒞。附件5 藥敏試驗檢測試劑盒（MIC測定）使用方法范圍本方法規(guī)定了動物源細菌（大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、魏氏梭菌和偽結(jié)核棒狀桿菌）藥敏檢測試劑盒的操作方法。 菌液制備將無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，直接取過夜培養(yǎng)皿上數(shù)個新鮮菌落，與適量無菌生理鹽水混勻。 菌液接種除空白對照外，其余的95孔加入制備好（用前要混勻）的菌液100181。 孵育將檢測板置于35℃177。擷偽氫鱧轍冪聹諛詼龐復堝窮馭餿職。附件6敏感性檢測結(jié)果統(tǒng)計表一、G菌（大腸桿菌、沙門氏菌和副豬嗜血桿菌）MIC 養(yǎng)殖場： 檢測員： 年 月 日婭鑠機職銦夾簣軒蝕騫設猶饌還館縉。四、腸球菌和魏氏梭菌MIC（促生長抗菌藥物監(jiān)測）養(yǎng)殖場：