艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法-wenkub
2023-06-10 18:19:08 本頁面
【正文】 球基金支持約 2400萬美元 ,中國政府配套約 700萬美元 . 。 什么是 HIV耐藥性 ? HIV耐藥性是指病毒通過自身的遺傳變異，產(chǎn)生對(duì)藥物抑制作用，使藥物敏感性降低或不敏感的現(xiàn)象。 耐藥性是怎么產(chǎn)生的 ? ? 病毒自身因素 — 內(nèi)因 ? 藥物的選擇壓力 — 外因 耐藥性是怎么產(chǎn)生的 ? ? 病毒自身因素 — 內(nèi)因 — HIVl的逆轉(zhuǎn)錄酶（ RT）不具有 DNA聚合酶的校正功能， 因此，在復(fù)制過程中，病毒核酸表現(xiàn)出高度的錯(cuò)誤傾向性。 Replication Rate Viral Load amp。 4. 其他因素 什么是好治療方案 ? — 能快速抑制病毒； — 不易產(chǎn)生耐藥性； — 可長(zhǎng)期維持； 耐藥性分類 原發(fā)性耐藥 (Primary resistance): 病人在接受抗病毒治療前產(chǎn)生了藥物作用靶點(diǎn)的變異，或者感染了耐藥毒株，均降低抗病毒藥物的敏感性。拉米夫定 (Lamivudine) Q151M mutation: 在 HIV1中出現(xiàn)低于 5%； HIV2中出現(xiàn)頻率較高。如 K103N、 Y181C。例如：逆轉(zhuǎn)錄酶（ RT） K103N的突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第 103位密碼子的氨基酸由天冬酰胺（ K）變成為賴氨酸（ N）。表型檢測(cè)可以直接檢測(cè)病毒的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測(cè)。 HIV基因型耐藥性檢測(cè) （序列測(cè)定法） 檢 測(cè) 流 程 病人血漿標(biāo)本 HIV RNA 病毒 cDNA HIV RT和 PR基因片段 序列測(cè)定 結(jié)果解釋 RNA提取 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增 特定的解釋系統(tǒng) 標(biāo)本 新鮮 EDTA抗凝血漿，或 80℃ 保存，避免反復(fù)凍融 病毒 RNA提?。? Qiagen公司試劑盒 ） 裂解標(biāo)本，滅活 RNA酶 加到離心柱中， RNA與硅膠膜結(jié)合 洗兩次，去除雜質(zhì) 用無 RNA酶的緩沖液洗脫 RNA 收集 RNA備用 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、得率高 逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 反應(yīng)體系： 10XBuffer 1?l dNTP ?l 外側(cè)反向引物 1?l RNase inhibitor ?l MMuLV RT ?l DEPC水 2?l RNA模板 5?l 42℃ 水浴 1小時(shí)， 95℃ 5 分鐘滅活 RT 巢式 PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系 ： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 外側(cè)正向引物 1?l 外側(cè)反向引物 1?l Taq酶 ?l 水 ?l cDNA模板 10?l 94℃ 5min， 94℃ 30sec， 55℃ 30sec， 72℃ 30循環(huán) 巢式 PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第二輪擴(kuò)增反應(yīng)體系 ： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 內(nèi)側(cè)正向引物 1?l 內(nèi)側(cè)反向引物 1?l Taq酶 ?l 水 ?l 第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物 10?l 94℃ 5min， 94℃ 30sec， 55℃ 30sec， 72℃ 30循環(huán) 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物純化 QIAquick Gel extraction試劑盒 核酸序列測(cè)定 雙脫氧鏈末端終止法 : Protease: CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGG
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