cr的原理與應(yīng)用ppt課件-wenkub
2023-05-27 13:49:56 本頁面
【正文】 ccus kodakaraensis, Invitrogen) ? Dynazyme DNA聚合酶 （ Thermus brockianus， Finnazyme） ? FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus？，復(fù)旦大學(xué) ) ? Tma, Tne, KOD, …… PCR儀器的變遷 ? 三個(gè)水浴鍋， 用手移動(dòng) （ Mullis等人當(dāng)時(shí)用的） ? 電加熱塊 ＋ 自來水冷卻 （ PE， 1988） ? 電加熱塊 ＋ 內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （ PE， 1989） ? 三個(gè)加熱塊 ＋ 機(jī)械手 （ Stratagene， 1994） ? 半導(dǎo)體制冷和加熱 （ MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） ? 溫度梯度 , 熒光檢測(cè) (如 Roche的 Lightcycler) ? 風(fēng)加熱 ? Labonchip式的 PCR儀 (所謂的芯片 PCR) 中國的狀況 ? 1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋 +機(jī)械手的原始 PCR儀（華美，復(fù)日等） ? 現(xiàn)在以半導(dǎo)體（ Peltier板）制冷式為主（杭州博日 ,上海天呈 , 廈門安普利等） PCR的發(fā)展史 ? 1983年春， Mullis發(fā)展出 PCR的概念； ? 1983年 9月， Mullis用大腸桿菌 DNA聚合酶做了第一個(gè) PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)； ? 1983年 12月，用同位素標(biāo)記法看到了 10個(gè)循環(huán)后的 49 bp長度的 第一個(gè) PCR片斷； ? 1985年 12月 20日， Mullis的同事 Saiki在 Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了 PCR技術(shù)，導(dǎo)致 Mullis的文章到處被拒； ? 1985年 10月 25日申請(qǐng)了 PCR的專利， 1987年 7月 28日批準(zhǔn)（專利號(hào) 4,683,202 ），這回 Mullis是第一發(fā)明人。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入 DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。 他原本是要合成 DNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作， 卻常為沒有足夠多的模板 DNA而煩惱。 1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè) 引物 （而不是一個(gè)引物） 去擴(kuò)增模板 DNA 的想法 …... 很少有在公司工作的科研人員得 諾貝爾獎(jiǎng)， Mullis是其中之一 Mullis開車的時(shí)候 , 瞬間感覺兩排路燈就是 DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是 DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著 DNA， …… Mullis的第一個(gè) PCR實(shí)驗(yàn) ? 1983年 9月中旬。1983年 12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的 PCR條帶。 ? 1986年 5月， Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí) PCR的方法； ? 1986年 6月， Cetus公司純化了第一種高溫菌 DNA聚合酶， Taq DNA polymerase，這是 85年春天 Mullis建議做的； ? 1988年，第一臺(tái) PCR儀問世； ? 1991年， Hoffman LaRoche以 3億美元的代價(jià)從 Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。 因此，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候絕對(duì)不要忘了負(fù)對(duì)照。無論使用何種 RNA，關(guān)鍵是確保 RNA中無 RNA酶和基因組 DNA的污染。 兩步法 RTPCR示意圖 一步法 RTPCR示意圖 兩步法 RTPCR 一步法 RTPCR 起始第一鏈 cDNA合成使用： 起始第一鏈合成使用 Oligo(dT)，隨機(jī)六聚體， GSP引物 GSP引物 優(yōu)點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) ?靈活 ?方便 引物選擇 擴(kuò)增酶同逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)先混合 擴(kuò)增酶的選擇 轉(zhuǎn)管步驟少，減少污染可能性 ?困難 RTPCR的優(yōu)化能力 ?高靈敏度 ?適用于在單個(gè)樣品中檢測(cè)幾個(gè) mRNA ?適用于大量樣品分析 一步法和兩步法 RTPCR的比較 EcoRI 寡聚 (dT)1218 隨機(jī) 6堿基引物 R6 寡聚 (dT)1218 隨機(jī) 6堿基引物 R6 mRNA (A)n (T)1218 (A)n (A)n (T)1218 R6 R6 R6 R6 R6 R6 第二鏈合成 (A)n (T)1218 (A)n R6 R6 R6 R6 R6 R6 (A)n (T)1218 EcoRI 加上 EcoRI接頭，磷酸化， cDNA分級(jí) cDNA合成完畢，準(zhǔn)備連接 第一鏈合成 cDNA合成過程示意圖 cDNA序列的克隆 （二） PCR的種類 PCR： 巢式 PCR ?原理： 利用兩套 PCR引物（巢式引物）對(duì)進(jìn)行兩輪 PCR
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