cr擴增產(chǎn)物的分析ppt課件-wenkub
2023-05-20 12:06:29 本頁面
【正文】 濃度的溶液中染色 10～ 15min – 瓊脂糖凝膠 EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般 5ng – 溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡 30min后再觀察 核酸電泳的染色劑 ? 銀染色：銀染色液中的銀離子 (Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使 Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色 ? 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色 ? 靈敏度比 EB高 200倍，但銀染色后， DNA不宜回收 電泳 ? 電泳裝置 –電泳儀 –電泳槽 –灌膠模具等 電泳儀 ? 普通電泳儀 ? 高壓電泳儀 電泳槽 ? 水平平板 ? 垂直平板 電泳方法 ? 用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子 ? 根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般 200～ 400 bp 的 DNA片段（可配制 ～ %） 電泳方法 配制瓊脂糖凝膠及倒膠 ? TBE電泳緩沖液 100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至 60℃ (需要時可加入 EB)，倒入電泳槽中，待凝固 ? 向電泳槽中倒入 TBE，其量以沒過膠面 2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去） 電泳方法 上樣與通電 ? 在 DNA樣品中加入 ，混勻后，加入樣品孔內(nèi) ? 接通電源，一般紅色為正極黑色為負極，切記 DNA樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為 1 — 5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算） ? 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳，一般 200～ 400bp 的 PCR產(chǎn)物 50V電壓，電泳20～ 40min 電泳方法 結(jié)果觀察 ? 紫外儀上觀察電泳帶及其位置 ? 并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴增產(chǎn)物的大小 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于 1Kb的DNA片段和 DNA序列分析 ? 其裝載的樣品量大，回收 DNA純度高，長度僅相差 %（即 500bp中的 1bp）的核苷酸分子即能分離 聚丙烯酰胺凝膠 ? 由丙烯酰胺單體，在催化劑 TEMED（ N，N， N， N‘一四甲基乙二胺）和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑， N， N39。一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 ? 聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的 不同濃度丙烯酰胺和 DNA有效分離范圍 丙烯酰胺 （ %） 有效分離范圍（ bp） 溴酚蘭 * 二甲苯青 * 100～ 2022 100 460 80～ 500 65 260 60～ 400 45 160 40～ 200 30 70 25～ 150 15 60 10～ 100 12 45 材料 ? 電泳儀器： – 電泳儀 – 垂直電泳槽及其附件 . ? 30%丙烯酰胺 – 丙烯酰胺， 29
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