cr法獲取目的基因ppt課件-wenkub
2023-05-27 13:49:55 本頁(yè)面
【正文】 引物 DNA聚合酶 2022/5/26 7 PCR法獲取目的基因 1983年 Mullis的構(gòu)思 94℃ 55℃ 37℃ 2022/5/26 8 PCR法獲取目的基因 1983年春夏之交的一個(gè)晚上， Mullis開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用 兩個(gè)引物去擴(kuò)增模板 DNA 的想法。一般樣品經(jīng)過 30次循環(huán) ,可使基因的拷貝數(shù)達(dá)到數(shù)百萬。 4） 用途廣泛 ：生命學(xué)科、醫(yī)學(xué)工程、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué) 2022/5/26 13 PCR法獲取目的基因 三、 PCR技術(shù)的反應(yīng)體系和條件 H2O 35 μL 10 PCR反應(yīng)緩沖液 5 μL 25mmol/L MgCl2 4 μL 4種 dNTP 4 μL 上游引物 （ 引物１ ） μL 下游引物 （ 引物２ ） μL 模板 DNA (約 1ng) μL Taq酶 μL （ 總體積： 50 ?L） 2022/5/26 14 PCR法獲取目的基因 PCR技術(shù)的基本過程 (1) 模板 DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ 預(yù)變性 模板 DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ TaqDNA聚合酶 94℃ 5min 2022/5/26 15 PCR法獲取目的基因 PCR技術(shù)的基本過程 (2) Taq 酶 模板 DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ 循環(huán)儀 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 5～ 7 min 2022/5/26 16 PCR法獲取目的基因 Taq 酶 模板 DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ PCR技術(shù)的基本過程 (3) 瓊脂糖凝膠電泳 2022/5/26 17 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 18 注意事項(xiàng) 1. EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性 ， 配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套 ,并且不要把 EB灑到桌面或地面上 。 從膠上回收 DNA時(shí) ， 應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈 (300360nm） ， 以減少紫外光切割 DNA。 ? PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。 通常應(yīng)在 5’端限制酶位點(diǎn)外再加 34個(gè) 保護(hù)堿基 ； ⑧ 引物不產(chǎn)生 false priming：不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ) ， 避免錯(cuò)誤引發(fā) PCR擴(kuò)增 。Cl (20℃下 )、 50 mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的 Mg2+； ② Tris在 PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)、 EDTA等可能影響 Mg2+離子濃度的物質(zhì)），以保證最適 Mg2+濃度； ③ dNTP可與 Mg2+結(jié)合 ：使游離的 Mg2+濃度下降 ,影響 DNA聚合酶的活性。 dNTP原液可配成 510mmol/L并分裝，20℃貯存。 ⑤循環(huán)次數(shù)： 主要取決于模板 DNA的濃度，一般為 2535次 。 ? 純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。 ? PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用 濾膜過濾除菌或高壓滅菌。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 30 ? 陽(yáng)性對(duì)照 :在建立 PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有 PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是 PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 31 ? 陰性對(duì)照 :每次 PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。② PCR反應(yīng)液制備區(qū) 。 ? 吸樣槍 :吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 34 ? 減少 PCR循環(huán)次數(shù)， 只要 PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 36 ?PCR儀 、 臺(tái)式離心機(jī) 、 滅菌的微量離心管 、 凝膠電泳系統(tǒng)等 ?TaKaRa Taq (5U/181。l (10mmol/L) P2: 1 181。l) 10 緩沖液（ Mg2+） : 5 181。l PCR產(chǎn)物 ， 采用 ％ 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物的量 ， 檢測(cè)引物擴(kuò)增的特異性 ， 并可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核酸的量粗略計(jì)算 PCR產(chǎn)物的總量 。 用途 ： 制備核酸序列測(cè)定的模板 制備雜交探針 四、 PCR的類型 2022/5/26 42 PCR法獲取目的基因 高濃度引物 低濃度引物 2022/5/26 43 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 44 PCR(touchdown PCR) ? 多循環(huán)的反應(yīng)程序使退火溫度越來越低。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 45 PCR(hot start PCR) ? 熱起動(dòng) PCR是除了設(shè)計(jì)好的引物之外，提高 PCR特異性最重要的方法之一。 ? 進(jìn)行反應(yīng)之前，先不加 Taq酶，等溫度上升到 72 ℃ 后再加入 Taq酶。 PCR (reverse PCR) 目的 ：是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的 DNA片段，對(duì)某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 用途 ：特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷； 可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分。 2022/5/26 54 PCR法獲取目的基因 （ 2） 原位 PCR的作用 鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于 10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。 2022/5/26 55 PCR法獲取目的基因 （ 3） 操作步驟 ① 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后使得一般 PCR試劑 （ 包括引物和 Taq酶 ） 能夠進(jìn)入細(xì)胞 ② PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段 ③ 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 mRN
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