核酸分子雜交ppt課件(2)-wenkub
2023-05-27 04:01:53 本頁面
【正文】 A260/A280）可反映核酸的純度 ? 純品的 A260/A280的值為 ， ? 低于 A260/A280，有蛋白質(zhì)或酚的污染。 ? 放置合適大小的梳子，將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠模中，凝膠厚度在 35 mm之間，大約需要凝固 20min。 ? 核酸分子雜交是指非同一分子來源但具有互補(bǔ)序列(或某一區(qū)段互補(bǔ) )的兩條多核苷酸鏈，通過 Watson—Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程。 ? 同時也可以利用 Northern雜交來檢測不同生長發(fā)育階段和不同的組織部位相關(guān)基因的表達(dá)情況。 ? 若經(jīng)雜交，樣品中無雜交帶出現(xiàn)，表明雖然外源基因已經(jīng)整合到植物細(xì)胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下該基因并未有效表達(dá)。 – 多糖、次生代謝物 ? 核酸的保護(hù)（ 內(nèi)源 RNA酶 ） – 低溫、苯酚、氯仿、 SDS可以部分抑制 RNA酶的活性，保護(hù) RNA不被酶解。 ? 膜上印跡雜交 – 將待測的 DNA或 RNA分子經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后原位轉(zhuǎn)移到固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上 – 雜交液（液相）中的探針與印跡到固相膜上的特異片段發(fā)生雜交 實驗原理 ? 分子雜交的實驗涉及到的三項技術(shù) – 核酸凝膠電泳技術(shù) – 印跡技術(shù) – 分子雜交技術(shù) ? 分子雜交的實驗涉及到的三大內(nèi)容 – 制備被檢的核酸或蛋白質(zhì)樣品 (或標(biāo)本 ) – 制備雜交探針 – 印跡及雜交 實驗原理 實驗設(shè)備 ? 常規(guī)設(shè)備 – 移液器， tip頭，離心機(jī) ? RNA電泳 – 金屬浴，水 平凝膠電泳儀，微波爐， 紫外凝膠成像系統(tǒng) ? 紫外分光光度計 ? 轉(zhuǎn)膜過程 – 3M濾紙，普通濾紙，尼龍膜，托盤，玻璃板，封口膜， 1000克重物，吸水紙，保鮮膜，手術(shù)刀片，刀柄 ? 預(yù)雜交、雜交 – 水浴搖床，雜交袋，封口器 ? 洗膜、信號檢測 – 搖床，雜交袋， X光片，暗室，暗盒 實驗試劑 ? RNA提取液（ TSE） ? 100 mmol/L TrisCl ? 20 mmol/L EDTA ? 200 mmol/L NaCl ? 1%SDS ? PVPP 、 β巰基乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇 ? 瓊脂糖、 MOPS、 EB ? 20 SSC: 3 mol/L NaCl， mol/L 檸檬酸鈉（ PH ） ? 鮭精 DNA ? 雜交液： 7% SDS， 50mmol/L Na3PO4（ pH ）， 2% blocking stock solution， 5 SSC， 50％甲酰胺， %Sodium Nlauroyl Sarcoine ? Buffer I: mol/L maleic acid， mol/L NaCl（ pH ） ? Buffer II: 10% blocking stock solution (Antidig) ? Buffer III: mol/L Tris， mol/L NaCl () (CDPstar) ? Washing 1： 2 SSC， % SDS ? Washing 2： SSC， % SDS ? 顯影液、定影液 實驗試劑 ? 轉(zhuǎn)基因煙草葉片 ? 煙草的 NLF基因及標(biāo)記基因 GUS 實驗材料 本部分實驗總流程圖 預(yù)雜交、雜交 RNA提取 1 2
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