【正文】 ↓ 第二輪：變性 — 退火 — 延伸 ?呈指數(shù)增長 理論值：一輪一倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109 理論 模板擴(kuò)增 30輪 1ng1g 實(shí)際 模板擴(kuò)增 30輪 1ng10?g ?1 Taq DNA聚合酶 ： ? 水生棲熱菌 (thermus aquaticus,Taq)的 DNA聚合酶 ? ① 5’?3’DNA聚合酶活性； ? ②無 3’?5’外切酶活性 ， ? 35輪 %錯配 ， 與原始模板有差別； ? 最適聚合酶 溫度 72℃ ，選擇 72℃ 延伸 ? 半衰期： ℃ 130min ? 95℃ 40min ? ℃ 5— 6min ? 變性溫度： ≤ 95℃ 使其在整個擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性 （二）基本要素 pfu DNA 聚合酶 ? 耐熱 ? 5’?3’DNA聚合酶活性 ? 3’→ 5’外切酶活性 ? 精確度： pfu Taq 但 pfu擴(kuò)增效率通常比 Taq酶略差 ? 文獻(xiàn)報(bào)道： Taq+pfu 會起到較好效果 ? ? 2 .引物 ? 人工合成短寡核苷酸 20bp25bp→ Tm=55℃ 60℃ ， ? Tm值要相近 ， 每條 1050pmol /100?l ? ◆ 設(shè)計(jì)原則： 164。 ? 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 （ mRNA）及其含量 。 （二） RNA 電 泳 二 核酸雜交技術(shù) ? （一） Southern Blot ? 原理： 將待檢測的 DNA分子用 /不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于 200～ 1000bp的片段 。 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離 5－ 500bp的片段 。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 （二） Northern Blot 操作過程 mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光 （三）探針標(biāo)記技術(shù) ? 1 標(biāo)記物 ： 放射性和非放射性兩種 ? 放射性： ? 非放射性： 生物素 、 地高辛素 、熒光素 ? 標(biāo)記方法 ? （ 1） 切口平移法 ? （ 2）隨機(jī)引物法 ? （ 3）末端標(biāo)記法 ? （ 4）單鏈 DNA探針標(biāo)記 ? （ 5） 寡核苷酸探針標(biāo)記法 32P、 35S和 3H 三 PCR技術(shù) ? PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚 DNA作為引物，通過加溫變性－退火－ DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的 DNA片段得到擴(kuò)增。 （ 1） 靠近 539。 —— 上 游 Primer ? —— 下游 Primer 負(fù)鏈 339。 ? 負(fù)鏈 339。然后倒過來 539。 （ 2） Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列 形成 loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu) 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （ 3）注意減少 Primer間互補(bǔ)序列 導(dǎo)致 2個 Primer形成 dimer 一般不要超過 3個互補(bǔ) bp 如： CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC ? ? ? 修飾 ? 如： 32P、生物素、熒光素，不影響其效果 ? 突變： ? AGCTCCATGACCCAG ? 539?！?339。 ∴ 如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的 Mg2+濃度 （ 1）變性溫度： 9495℃ Templete： GC比例高、長度很長，則變性 T↑ （ 2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好 取決于 Tm值： Tm↑ 退火 T↑ ； Tm↓ 退火 T↓ 若 Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度 （ 3）延伸： ?500nt1min ?500nt－－ 3min 一般： 40－ 60sec ： （三） PCR技術(shù)的應(yīng)用 ? 1. 基因檢測： ? 2. 基因克隆化 ? 3. DNA突變 ? 4. DNA序列分析 四、基因芯片 ? 利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于 DNA、 RNA的研究 背景資料 基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用點(diǎn)樣機(jī)等機(jī)械裝置，在玻璃等支持物表面整齊地點(diǎn)上高密度的、成千上萬個 “ 點(diǎn) ” ，每個 “ 點(diǎn) ” 含有可與一種基因雜交的一條ＤＮＡ探針。經(jīng)激光共聚焦掃描儀等裝置掃描后，所獲得的信息經(jīng)專用軟件分析處理，即可獲得成千上萬種基因的表達(dá)情況。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析技術(shù) ? 講述內(nèi)容： 一 、 Western Blot 二 、 ELISA 三 、 免疫熒光技術(shù) 四 、 免疫組織化學(xué)技術(shù) 五 、 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 一 Western Blot ? 1 原理 ： ? 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 ? 方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極 ? 排去濾紙、膠和膜間的氣泡。一張膜可以重復(fù)使用 3－ 4次。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。 二、 ELISA ELISA 常用的酶和底物 ? 辣根過氧化物酶，底物為 OPD, 深桔黃色 ，檢測波長 492nm ? TMB， 藍(lán)綠色，檢測波長 450nm