三重復(fù)合誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選林可霉素高產(chǎn)菌株項(xiàng)目可行性研究報(bào)告-wenkub
2023-05-09 13:49:17 本頁面
【正文】 裝訂成冊(cè)。三重復(fù)合誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選林可霉素高產(chǎn)菌株項(xiàng)目可行性研究報(bào)告三重復(fù)合誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選林可霉素高產(chǎn)菌株項(xiàng)目可行性研究報(bào)告編 寫 說 明一、本可行性研究報(bào)告格式適用于某市科技計(jì)劃（軟科學(xué)研究計(jì)劃、國際科技合作與交流計(jì)劃除外）項(xiàng)目開展可行性研究時(shí)使用，其主要依據(jù)是相應(yīng)的某市科技計(jì)劃項(xiàng)目申請(qǐng)書。一、總論（一） 項(xiàng)目的主要內(nèi)容及技術(shù)原理簡述主要內(nèi)容：本研究基于以林可霉素產(chǎn)生菌林可鏈霉菌(Streptomyces Linloinensis)為出發(fā)菌株，采用加熱、紫外線(UV)、DES三重復(fù)合誘變處理，用終點(diǎn)產(chǎn)物林可霉素為選擇壓力進(jìn)行梯度篩選，經(jīng)搖瓶初篩、復(fù)篩獲得較高效價(jià)菌株，最后用正交設(shè)計(jì)來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。本項(xiàng)目完成時(shí)篩選到高產(chǎn)穩(wěn)定融合菌株，50立升發(fā)酵罐林可霉素發(fā)酵單位達(dá)到7000u/ml，優(yōu)化高產(chǎn)穩(wěn)定菌株的罐上發(fā)酵工藝用于生產(chǎn)林可霉素。誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。第二，出現(xiàn)的突變體類型較多。3. 原生質(zhì)體融合技術(shù)原理把兩個(gè)親本的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以瓦解，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體（稱原生質(zhì)體）。菌株的基因發(fā)生改變，隨之其代謝途徑也會(huì)發(fā)生改變。由于其對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力強(qiáng)，應(yīng)用方便，不需做皮試，臨床上用于肺炎球菌、溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌及金黃色葡萄球菌的感染。傳統(tǒng)育種方法，盲目性大、實(shí)效差，在2O世紀(jì)7O年代發(fā)展起來的雜交育種方法受到遺傳標(biāo)記的限制，應(yīng)用較少。目前，利用離子注入技術(shù)對(duì)抗生素產(chǎn)生菌誘變處理國內(nèi)已有一些報(bào)道[16],氮離子注入技術(shù)用于林可霉素產(chǎn)生菌的誘變,取得了一定的效果。林可鏈霉菌()合成一共需18 種酶的參與: 8個(gè)酶參與PPL合成,另8個(gè)酶參與αMTL合成,還有2個(gè)酶控制縮合兩個(gè)組分形成終產(chǎn)物。由于其對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力強(qiáng)，應(yīng)用方便，不需做皮試。雖然皖北藥業(yè)股份有限公司利用先進(jìn)的基因工程技術(shù)對(duì)林可霉素菌種進(jìn)行改良、篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的林可霉素產(chǎn)生菌，搖瓶效價(jià)達(dá)到4500μ/ml以上。林可霉素在我國的應(yīng)用已有多年歷史，正處市場銷售成熟期。原因主要有以下三方面：（1）缺乏高產(chǎn)菌株，或者菌種退化；（2）工藝有待優(yōu)化；（3）生產(chǎn)管理不善（責(zé)任心不強(qiáng)、操作工素質(zhì)不高、工藝變形）?！ ?目前，學(xué)院正以鄱陽湖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)為契機(jī)，圍繞省學(xué)科建設(shè)，加強(qiáng)對(duì)外交流與合作，努力實(shí)現(xiàn)高位嫁接，與中國科學(xué)院廬山植物園建立植物生態(tài)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室?，F(xiàn)有資產(chǎn)總額41228萬元，凈資產(chǎn)10378萬元。1992年獲華東理工大學(xué)生物化工專業(yè)“工學(xué)碩士”學(xué)位。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表研究論文11篇；曾獲上海市第四屆化學(xué)化工研究生論文報(bào)告會(huì)優(yōu)秀論文獎(jiǎng)。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有大型儀器設(shè)備比較齊全、真空冷凍干燥器、高速冷凍離心機(jī)、帶有尾氣分析的30L高級(jí)生物反應(yīng)器等。（二）項(xiàng)目的主要研究（開發(fā)）內(nèi)容研究內(nèi)容：1. 出發(fā)菌株的自然分離，在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變，多因素低劑量的誘變效應(yīng)來篩選穩(wěn)定生產(chǎn)林可霉素的突變株；2. 以林可霉素生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，采用加熱、紫外線(UV)、DES三重復(fù)合誘變處理，用林可霉素和前體為選擇壓力，壓力梯度法篩選耐自身終產(chǎn)物的高產(chǎn)菌種及用甲硫氨酸為前體物篩選耐前體物的高產(chǎn)菌種；3. 用雙親本菌株原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選高產(chǎn)穩(wěn)定的林可霉素菌株；4. 高產(chǎn)穩(wěn)定融合菌株發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝優(yōu)化及中試放大。因而可被用來對(duì)微生物的某一特殊性狀進(jìn)行改良，并且容易出現(xiàn)高產(chǎn)的突變體。第三，與其它誘變方法相比，三重誘變后產(chǎn)生的顯性突變體相對(duì)較多，因而易于篩選突變體。（4）根據(jù)菌落形態(tài)，挑選出60株不同形態(tài)的菌株接到60個(gè)大試管斜面中30℃，培養(yǎng)7天。（4）從冷卻后的三角瓶中取出5ml放入直徑為7cm的平皿內(nèi)置于15W，30cm距離的紫外燈下照射30s，然后在暗處放置10min.（5）從小平皿內(nèi)各吸取1ml，分別加入3只100ml搖瓶內(nèi)，在3只搖內(nèi)分別加入0ml, ，在30℃，200r/min的搖床上振蕩三小時(shí)。5. 重組菌株的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化的優(yōu)化（六）技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)分析本項(xiàng)目把經(jīng)典的誘變方法與
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