【正文】 微鏡下觀察control組的細(xì)胞是否消化下來，如沒有消化下來，用槍吹打至細(xì)胞完全消化后，每孔加入500ml 10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液終止消化，1200 rpm離心5min，棄上清，加入400 ml 10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450nm 波長測定其吸光度。再以轉(zhuǎn)圈的方式加入200ml細(xì)胞重懸液至材料表面，輕微震蕩)，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。直接在材料上種細(xì)胞的CCK8實驗方案1. 準(zhǔn)備一個小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物，用75%的乙醇滅菌10 min，將材料轉(zhuǎn)移至24孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍，加入800ml培養(yǎng)基使材料浸沒在培養(yǎng)基中。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。）10. 2天換液一次，等到細(xì)胞長滿之后，對細(xì)胞進行傳代，傳至第三代即可進行凍存和做實驗用。7. 用1ml注射器插入到骨髓腔中，并不斷用medium進行吹打，直至腔體發(fā)白為止，再用1ml槍頭吹打培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，以免細(xì)胞成團。4. 左手拿鑷子將SD幼鼠后腿腳掌夾起，右手持剪刀沿著SD幼鼠后腿將皮剪開，且將皮剪至股骨部分，要將皮剪開點，以免沾到毛發(fā)。洗凈后自行晾干、濾紙吸干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存7. 細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)公式：計算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=16小格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)104稀釋倍數(shù)5. 細(xì)胞計數(shù)時，計數(shù)區(qū)是由4個16格小方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格(A、B、C、D)的細(xì)胞數(shù)，數(shù)完計4個大方格讀數(shù)的平均數(shù)。3. 將懸液搖勻，用移液器吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多），讓懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高，可用吸水紙吸去溝槽中流出的多余懸液。f. 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。c. 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細(xì)胞。TIPS：a. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase)且存活率高之狀態(tài)，約為8090%致密度。建議吸管在吸取液體前盡量排空氣體，緩慢松手以吸取更多液體，繼而以合適的力度吹勻細(xì)胞。EDTA可以螯合2價金屬離子，故常用TE溶液。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。7. 棄上清液，加入適量PBS，重懸后1200rpm離心3分鐘。消化程度以用肉眼觀察當(dāng)培養(yǎng)皿晃動時飄起單層細(xì)胞為準(zhǔn)，可在顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度，視細(xì)胞不同而調(diào)節(jié)。材料準(zhǔn)備：TE消化液、FBS、對應(yīng)培養(yǎng)基、50ml離心管若干、15ml離心管若干、一次性吸管若干、培養(yǎng)皿等實驗步驟：1. 觀察細(xì)胞生長狀況后，取出實驗所需物品，可在50ml離心管中配制40ml培養(yǎng)基（4ml FBS+36ml aMEM）待用。b. 細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。3. 小心打開凍存管，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到有培養(yǎng)基的15ml離心管中。常見生物相容性實驗匯總細(xì)胞復(fù)蘇材料準(zhǔn)備： 培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15mlamp。4. 1200rpm離心3min，棄上清，加入6ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶（小瓶6ml培養(yǎng)基，大瓶10ml培養(yǎng)基）中，做好標(biāo)記（細(xì)胞類型、傳代數(shù)、培養(yǎng)基、復(fù)蘇時間、復(fù)蘇人），置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后視情況換液。細(xì)胞傳代（TE消化法）實驗前準(zhǔn)備事項：1. 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（可以省去）。2. 用一次性吸管從細(xì)胞單層吸出培養(yǎng)基，緩慢加入PBS或者不含血清的培養(yǎng)基沒過細(xì)胞，搖晃洗滌培養(yǎng)皿1~2次。5. 消化適度后，加入適量培養(yǎng)基2~3ml于培養(yǎng)皿中終止消化，沿四個方向吹洗培養(yǎng)皿，確保細(xì)胞均從板上消化下來，最后全部轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。8. 棄上清液，先加入2~3ml含10%血清的培養(yǎng)基于15ml離心管中，將適量細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，做好標(biāo)記（細(xì)胞類型、傳代數(shù)PxNy、培養(yǎng)基DL傳代時間、傳代比例1:5；操作人），置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，清理操作臺，處理垃圾，記錄筆記。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強，針對不同細(xì)胞，建議初次消化時均在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以確定消化程度。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)基或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用，利用培養(yǎng)基稀釋也可以達到一定效果。細(xì)胞凍存材料準(zhǔn)備：TE消化液、FBS、對應(yīng)培養(yǎng)基、50ml離心管若干、15ml離心管若干、一次性吸管若干、專用凍存塑料管（1ml）等實驗步驟：將細(xì)胞凍存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱預(yù)冷；當(dāng)10 cm培養(yǎng)皿中的RBMSC細(xì)胞匯合到80%90%時，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，1200 rpm離心，去上清；加入PBS重懸細(xì)胞，以洗去殘留的胰蛋白酶，1200 rpm離心，去上清；加入1ml細(xì)胞凍存液重懸后，將細(xì)胞重懸液放入凍存管中，凍存管必須將蓋子蓋緊，防止液氮侵入，并做好標(biāo)記（細(xì)胞類型、培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)基、凍存時間、凍存人、編號）。b. 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。d. DMSO稀釋時會放出大量熱能，為了防止局部DMSO濃度過高，請滴加培養(yǎng)基并且不時搖晃，當(dāng)然，最佳的是配制好凍存培養(yǎng)基，加入離心管中對細(xì)胞沉淀小心吹打制懸。g. 專用凍存塑料管，帶有螺旋的平底塑料蓋，并且可以耐受低溫，注意凍存時擰緊。4. 靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體漂移。為了保證計數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計數(shù)和漏記，在計數(shù)時，對沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。SD幼鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取1. 準(zhǔn)備好已滅菌的手術(shù)器械和需要用到的離心管、培養(yǎng)皿等器材，于紫外照射30min滅菌。找到股骨與身體相連的關(guān)節(jié)處剪斷，取出后腿，并將腳掌與脛骨相連位置的皮剪掉，去除腳掌，余下部分放置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中。8. 用細(xì)胞濾網(wǎng)對培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液進行過濾，去除液體中的組織和肉末，將濾液放入10 cm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。CCK8 實驗?zāi)康模嚎疾旌辖鸶男郧昂髮?xì)胞毒性的變化 細(xì)胞：小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3E1，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RBMSC 實驗原理：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。（若材料為鈦合金，可把75%滅菌后的材料放置于超凈臺，再用紫外照射一段時間后，將材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培養(yǎng)基進行清洗。每個材料4個復(fù)孔。（其他材料：待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)1,3,7天，棄培養(yǎng)基， PBS洗2次(PBS需吸干)，清洗后，將材料轉(zhuǎn)移至別的空白孔中，每孔加入400ml10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450 nm 和650 nm波長測定其吸光度。備注：①一個方塊材料為1cm2，一塊材料消耗1ml培養(yǎng)基②在材料上培養(yǎng)細(xì)胞時，需每天進行換液，防止鎂合金腐蝕對細(xì)胞造成影響。材料浸提液CCK8的實驗方案對材料先進行封膠處理，封膠時底面只弄一次，盡量平整、薄。將材料于75%的乙醇中滅菌10 min，再用PBS清洗3次，轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入培養(yǎng)基后在桌面來回動1020 s。取70%80%對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，計數(shù)，在96孔板上種細(xì)胞，密度為5*103/孔，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。：在空白孔中加入與實驗組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度即為空白對照。本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長、運動、分裂、分化、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、基因表達等都起到重要作用。實驗方案：1. 準(zhǔn)備一個小燒杯，將材料浸沒在裝有乙醇的小燒杯中滅菌1015min。(先加入800ml培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。）3. 細(xì)胞孵育5h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS震蕩清洗兩次（24h時間點：加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，用PBS振蕩清洗兩次），%甲醛（PBS中）在室溫下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。省染料的做法：取封口膜一塊，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使細(xì)胞直接接觸染料染色，注意過程中染料不能干。熒光：1 通道：DAPI， 2通道： FITC，3通道：羅丹明觀察：1. 細(xì)胞骨架形態(tài)是否發(fā)生變化 2. 肌動微絲是否出現(xiàn)增粗 3. 細(xì)胞間連接是否增多 4. 細(xì)胞形態(tài)：多角形變成梭形，偽足明顯增多注意：DAPI和鬼筆環(huán)肽具有劇毒性，在使用的時候應(yīng)盡量小心，一定要帶手套操作，避免將染料弄到皮膚上。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,SEM觀察細(xì)胞的樣品制備目的：比較Magnesium alloys表面改性前后的細(xì)胞直接粘附材料表面的狀態(tài)細(xì)胞：小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3E1方案：7. 準(zhǔn)備一個小燒杯，將材料浸沒在裝有乙醇的小燒杯中滅菌10min。(先加入800ml培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。固定是利用化學(xué)試劑使細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)或化學(xué)成分保持生前狀態(tài)。但是由于冷凍干燥需要低溫條件，且時間長（通常需要數(shù)小時或數(shù)十小時），樣品也較容易凍傷或產(chǎn)生冰晶。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,促成骨相關(guān)實驗配制成骨分化誘導(dǎo)液 將50 mg ASAP溶解于10 ml aMEM配制成濃度為5mg/ml(100X)的儲存液，℃保存,工作濃度為50mg/ml。配制10%的氯代十六烷基吡啶目的：為茜素紅定量測OD值做準(zhǔn)備步驟：1. ，配制成10mM磷酸氫二鈉溶液。材料數(shù)量：每種材料3個時間點（7day，14day，21day），每個時間點4個平行樣。4. PBS洗3次，加入20 mg/ml ℃培養(yǎng)箱染色30min；(染料要沒過材料)5. 棄茜素紅，PBS洗6次至無色。從圖a可知，四種材料均能夠促進rBMSCs細(xì)胞的成骨分化，經(jīng)過等離子注入的材料對細(xì)胞的促成骨效果比純鈦強，且Zn/AgPIII材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促成果效果更佳有效。3. 細(xì)胞貼壁生長至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導(dǎo)液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導(dǎo)液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)后期，需每天對細(xì)胞進行換液，以保證能夠提供足夠的營養(yǎng)；同時，在誘導(dǎo)后期，對細(xì)胞進行換液一定要小心），棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。產(chǎn)物黃色越深，吸光度越大，說明堿性