【正文】 I先用超純水配成5mg/ml的儲存液，保存在20℃，此乃原始儲存液。此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N，BD有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。）顯微鏡照相和細胞計數(shù)：取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)一般采用510個，隨機選取，統(tǒng)計計數(shù)。5細胞染色用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞染色：%結(jié)晶紫染色。l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。3 接種細胞 取細胞懸液100－200181。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。使用前于4℃冰箱冰水混合物中融化過夜。HUVECS cells 實驗protocolTranswell1．實驗用品：小室: coster的24孔板的transwell的8181。 在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC/PI）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI）。結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。 用冰冷PBS洗滌細胞后， 1000g離心5 min，棄上清，加入500uL的Binding Buffer輕輕重懸細胞。2) PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。因此，有關(guān)凋亡的研究在臨床和基礎(chǔ)等各個領(lǐng)域已經(jīng)廣泛開展，凋亡細胞的檢測方法顯得非常重要。在酶標(biāo)儀下測定其OD值。25℃條件下，每分鐘水解paranitrophenyl phosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個Glycine酶活力單位。7. 在405nm測定吸光度。同時設(shè)置空白組和標(biāo)準(zhǔn)曲線組。a. 顯色底物溶液：取一管顯色底物，充分溶解和混勻，冰上放置。（細胞或組織裂解液的準(zhǔn)備：采用適當(dāng)細胞或組織裂解液裂解細胞和細胞，如果有必要需進行適當(dāng)勻漿，隨后離心取上清，用于堿性磷酸酶的檢測。實驗周期：7,14，21天實驗材料數(shù)量：每種材料三個時間點，每個時間點4個平行樣。6. 用正置顯微鏡拍照。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium, Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,天狼星紅染色目的：考察Titanium alloys 表面改性后對細胞成骨誘導(dǎo)后膠原蛋白結(jié)果的影響細胞：小鼠胚胎成骨細胞MC3T3E1直接實驗方案：1. 準(zhǔn)備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉(zhuǎn)移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在材料上種細胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板），使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。7. 每孔加入氯代十六烷基吡啶（10%）（要沒過材料表面）溶解后取150ul裂解液加入96孔板內(nèi)于620nm波長處測OD值注意事項：茜素紅染色的成功關(guān)鍵步驟是固定液的選擇和茜素紅的PH，這個很重要。每個材料4個復(fù)孔。3. 放入離心管內(nèi)加熱溶解備用；4. 最終10%的氯代十六烷基吡啶應(yīng)呈微黃色。 Dex溶于1223ml乙醇中，*103M。粘貼時應(yīng)注意動作輕巧，保持觀察面清潔。11. 干燥：采用冷凍干燥法，將脫水后的樣品投入液氮中，使樣品迅速冷凍，然后再把冷凍的樣品放入真空內(nèi)，讓樣品中已結(jié)成冰的溶劑及水分在高真空下升華，即由固體直接變成氣體，從而使樣品得以干燥。再加入200ml細胞重懸液至材料表面，輕微震蕩。材料放置孔板中部。同時，在4h的時候，與純鈦相比，其他三種實驗組均能夠明顯看到材料表面上的細胞明顯鋪展，且在Zn/AgPIII材料表面上細胞的微絲更明顯，說明Zn/AgPIII材料表面更適合細胞生長。打開顯微鏡，熒光，電腦。5. 在暗室中，取5ml ml(終濃度為165nM，加入鬼筆環(huán)肽（覆蓋即可，用完可以回收利用），室溫避光孵育40 min，吸出染液，用PBS清洗洗3次。再加入200 ml細胞重懸液至材料表面，輕微震蕩。材料放置孔板中部。羅丹明熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細胞的Factin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布。細胞CCK8實驗結(jié)果參照下圖：如圖所示，相同濃度浸提液與細胞共培養(yǎng)1天和3天后，100%WE43浸提液對細胞的毒性比較大，細胞存活率分別為60%和40%左右，而釹元素等離子注入WE43 100%浸提液與細胞共培養(yǎng)1天和3天后，細胞存活率分別為90%和100%左右，且在低濃度情況下釹元素等離子注入WE43能夠促進細胞增殖，表明經(jīng)過改性后的WE43具有良好的生物相容性。RGR(%)=(材料組吸光度空白組吸光度)/(對照組吸光度空白組吸光度) 100%表1 分級標(biāo)準(zhǔn)和評定結(jié)果0級1級2級3級4級5級RGR(%)≧1007599507425491240評定結(jié)果合格合格結(jié)合細胞形態(tài)綜合評價不合格不合格不合格注意事項：由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。進一步稀釋成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90 ml培養(yǎng)基和10 ml FBS位對照組，每一樣品設(shè)5個復(fù)孔。提取上層液在4℃中保存，（加過雙抗可不滅菌），離心去上清液（液體有揮發(fā)就補齊），4℃保存，材料回收。在用于浸泡之前，用2000砂紙對WE43再次進行打磨，以去除表面的氧化膜。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。（若為鎂合金的control組，則應(yīng)將control組中的細胞消化下來，再與CCK8進行孵育。48孔板，每孔300ml。若有氣泡，戳破。20℃干燥避光保存，有效期二年。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。（由于剛提取的細胞中含有多種雜質(zhì)，剛提取的細胞經(jīng)過過夜培養(yǎng)后，細胞上清液渾濁屬于正?，F(xiàn)象，在提取后的兩天內(nèi)，細胞要每天換液，且換液時候加PBS和10%FBS Medium 時候必須緩慢沿壁加入，以免將細胞吹起。6. 左手用鑷子將脛骨節(jié)氣，右手持剪刀對骨頭進行剔肉，盡量將骨頭上的肉剔干凈后，剪斷脛骨兩端的關(guān)節(jié)，使脛骨兩端相通后放入裝有10%FBS Medium 的培養(yǎng)皿中，股骨處理與脛骨相同。3. 將出生78 天的SD幼鼠處死，噴酒精后放入超凈臺的培養(yǎng)皿中。6. 測數(shù)完畢，取下蓋玻片，噴酒精將細胞計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強度。2. 取潔凈的細胞計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。不宜將凍存細胞放置在0℃～60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險溫區(qū)”。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。整理，做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄（細胞信息、具體凍存位置、管數(shù)等）。d. 用一次性吸管吹勻細胞時，切勿產(chǎn)生大量氣泡，在氣泡破裂時產(chǎn)生的剪接力對活細胞有致命威脅。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：DHanks液。b. 胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散，細胞從平板上脫落可以用槍頭吹打?qū)崿F(xiàn)，但必須觀察到細胞間已經(jīng)分離。精確配平后放入臺式離心機內(nèi)1200 rpm離心3分鐘。（視細胞種類也可不洗滌直接加入TE消化液）4. 稍加搖勻，使TE消化液均勻覆蓋皿內(nèi)所有細胞，置37℃條件下溫育1~3分鐘。3. 實驗前把可能用到的試劑、吸管及離心管等全部拿到廚內(nèi)，并正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。TIPS：a. 解凍細胞必須迅速，防止細胞低溫損傷，慢凍速融。2. 把培養(yǎng)基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜內(nèi)操作。50ml離心管實驗步驟：1. 先將培養(yǎng)基配好并復(fù)溫，在15ml離心管中加入5ml培養(yǎng)基；準(zhǔn)備37℃的水浴，取出凍存管后立即置于水浴中融化，確保細胞全部浸入液面，快速搖動，1min內(nèi)使管內(nèi)的細胞融化，注意不要讓水沒過管口，液氮會從口子噴出，小心。5. 復(fù)蘇后細胞生長狀況正常后，進行常規(guī)培養(yǎng)，最好在第二次傳代后凍存若干管細胞，不可只取不存，在第三次傳代后可用于細胞實驗。2. 用75％酒精擦拭雙手，生物安全柜經(jīng)過紫外線照射超過30min，實驗前通風(fēng)至少開啟15分鐘讓空氣循環(huán)起來，櫥內(nèi)不要使用火焰燈，它們會影響櫥內(nèi)空氣的流動方式。3. 再吸出PBS或培養(yǎng)基，吸的越干凈越好， 6cm（10cm）培養(yǎng)皿中加入600ml（800 ml）TE（胰蛋白酶），以剛剛沒過細胞為宜。6. 用吸管將已經(jīng)消化的細胞輕輕吹打成細胞懸液。TIPS：a. 消化適度：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。c. 每次傳代可以按1:3~1:10等比例進行，以ATCC數(shù)據(jù)建議和實際生長狀況考慮，請協(xié)商好細胞需要立即使用還是長期培養(yǎng)，合理保持培養(yǎng)箱中不同細胞的平板數(shù)量。按下列順序梯度降溫：室溫→4℃（10~20min）→冰箱冷凍室20℃（~）→低溫冰箱80℃（過夜）→液氮罐196℃（長期）（冰上轉(zhuǎn)移）。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。e. 梯度降溫轉(zhuǎn)移細胞時注意放置冰盒上，避免敏感溫度變化。細胞計數(shù)材料準(zhǔn)備：細胞計數(shù)器、Eppendorf 管等實驗步驟：1. 制備細胞懸液，可稀釋數(shù)倍以使每小格的細胞數(shù)可數(shù)。將細胞計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。如細胞位于大方格的粗線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。2. 先將培養(yǎng)基配好，并在培養(yǎng)皿中加入PBS和10% FBS Medium。5. 重新取新一套鑷子與剪刀，用鑷子將腿夾起，在脛骨與股骨關(guān)節(jié)相連處用剪刀剪斷，得到分離的脛骨與股骨。9. 第二天，去除上清液，PBS清洗兩次（要沿壁加PBS，以免將貼壁不牢固的細胞吹起），再加入10% FBS Medium 培養(yǎng)。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。保存條件： 4℃干燥避光保存，有效期一年（推薦）。）2. 取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在材料上種細胞，密度為3*104/孔（可根據(jù)材料調(diào)整細胞密度），使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面 (先加入800ml培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。（若材料為鈦合金，則可將細胞懸液配成配制濃度為2104個/mL的細胞懸液，分別注入已置入材料的無菌24孔板，每孔500μL。）4. 實驗對照組：種3*104/孔細胞于24孔板中，加入培養(yǎng)基分別孵育