應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點-生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位-wenkub
2023-04-19 23:21:59 本頁面
【正文】 白分析方法。在哺乳動物中大約有三分之一的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是磷酸化修飾的，對眾多生物化學(xué)功能起開/關(guān)調(diào)控作用，是一種普遍的調(diào)控機(jī)制。毛細(xì)管電泳（CE）可以分析蛋白質(zhì)或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鑒定蛋白質(zhì)磷酸化位點首先要用高效液相色譜（HPLC）分離蛋白的酶解肽段，然后用CE篩測磷酸化肽，最后用自動Edman降解氨基酸分析法確定其磷酸化位點，工作量大，不是快速和高通量分析方法。這種方法的成功建立，將使人們對磷酸化蛋白質(zhì)的研究跨上一個新的臺階，對功能性蛋白的尋找和作用機(jī)制探尋具有重要意義，在國內(nèi)具有廣泛的需求。固相金屬親和色譜（IMAC）法是近年來應(yīng)用最廣泛的特異性富集磷酸化肽段的方法，該方法適用于微量復(fù)雜樣品的處理。磷酸化蛋白βcasein蛋白為sigma產(chǎn)品，純度90％。儀器：電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（QTof2，Micromass），配有masslynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)。2) 離子親和層析IMAC法富集磷酸化肽段：①％乙酸／50％乙腈／水溶液洗3次，②用200mM Ga(NO3)3溶液洗10次，③用超純水洗3次，④用1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗3次， ⑤％乙酸／10％乙腈／水溶液洗5次，⑥蛋白質(zhì)酶解混合物用酸性溶液（20％乙酸或1％甲酸水溶液）調(diào)pH至2以下，用ZipTipMC吸取、排出10次以上，⑦％乙酸／10％乙腈／水溶液洗6次，⑧用超純水洗3次，⑨2－3μL ；3) 質(zhì)譜分析： 電噴霧質(zhì)譜儀為英國Micromass公司的電噴霧四極桿正交加速飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀QTOF2。源溫80176。當(dāng)進(jìn)行手動測序時，毛細(xì)管電壓為8001200V可得到穩(wěn)定的噴霧。所有
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