彗星實驗(英語版)-wenkub
2023-04-19 00:48:18 本頁面
【正文】 胞比CHO，V79修復明顯減慢而出現(xiàn)較多的殘余損傷，從而認為TK6與L178YR細胞系存在修復缺陷。 并比較了現(xiàn)有的幾種測乏氧細胞的方法，提示“彗星”法是測中央氧壓10 mmHg的腫瘤乏氧分數(shù)最敏感的方法［10］。射線在氧合好的細胞中產(chǎn)生的DNA損傷3～4倍于乏氧細胞。為臨床選擇治療方法提供依據(jù)。因大量的DNA斷片遷移形成脫離“彗頭”的巨大“彗尾”，二者很容易區(qū)分。 細胞內源性酶對損傷DNA灶進行切除及再連接修復，與此過程相吻合的是在SCGE中可相應的觀察到“彗尾”的出現(xiàn)與消失。Marty等［7］用SCGE研究p53基因對細胞增殖作用時發(fā)現(xiàn)p53缺陷型小鼠精子細胞DNA斷裂數(shù)目遠低于野生型，推測可能由于p53基因缺陷引起DNA交聯(lián)。 其二，處理組與對照組都加一標準的斷裂劑，這樣交聯(lián)的存在就會減少后者所致的DNA斷片釋放，與對照組相比“彗星”尾部減少的長度等指標與交聯(lián)的量成正比。 根據(jù)“彗星”圖像出現(xiàn)的情況就能準確測到某種射線是否造成DNA斷裂及斷裂情況。 不同品質的射線所致的損傷類型不同，如高LET射線引起雙鏈斷裂為主，低LET射線以致單鏈斷裂為主，而uv以引起堿基損傷為主。 因此，在嚴格控制影響因素后，才能使SCGE在檢測中發(fā)揮優(yōu)勢。目前測量的指標較多，主要有尾長、尾力矩、尾部DNA百分數(shù)、尾慣量等，但每一指標的應用均有它的局限性。其次，它能對單個細胞進行分析，故適用于體內、體外、不同實驗室、不同細胞的研究。 DNA斷片遷移的距離與DNA斷片分子質量和電荷數(shù)相關，DNA斷片越多、越小，“彗尾”越長，又因熒光染料與DNA的結合是特異性的，因此，通過測定 “彗星”尾部長度和熒光強度可推測DNA鏈斷裂情況。其原理如下：去污劑或高鹽裂解溶液破壞細胞膜，使得95%以上的蛋白質及細胞內其他成分滲出膜進入溶解液，DNA由于相對分子質量大而留在原位。 “彗星”分析法在放射生物學中的應用夏云飛 審校 “彗星”分析法（et assay）又叫單細胞凝膠電泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝膠電泳，是一種比較理想的單細胞水平檢測哺乳類有核細胞DNA損傷的新技術。電泳時小的DNA斷片在電場作用下移出細胞核。如為中性裂解液加上50 ℃的處理只能破壞DNA超螺旋結構，而DNA雙螺旋結構保存完好，只有小的雙鏈片段在電場作用下移出細胞核，形成 “彗星”尾部，故主要用于DNA雙鏈斷裂的檢測。 此法的突出優(yōu)點是靈敏度高。此外，此法還具有所需細胞樣本數(shù)少（10 000 個）、無需同位素標記、快速、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點。尾力矩為現(xiàn)常用的較靈敏指標。近年該實驗已廣泛用于放射生物學、遺傳毒理、生物監(jiān)測及腫瘤發(fā)病機制等多個領域。 1應用隨著射線LET的升高，單鏈斷裂減少，雙鏈斷裂增多。 111DNA單、雙鏈斷裂堿性SCGE是檢測DNA單鏈斷裂最靈敏的指標［5］，通常用SCGE測到的DNA斷裂與劑量呈線性關系。在中性環(huán)境下裂解、電泳后所測到的“彗星”圖像則可代表DNA雙鏈斷裂情況，因為雙鏈斷裂比單鏈斷裂出現(xiàn)的機率少25～40倍，故所用射線的劑量應大，并且要用嚴格的裂解液，檢出雙鏈斷裂的最少劑量是5 Gy。 112檢測DNADNA鏈間交聯(lián)、鏈內交聯(lián)及DNA蛋白質交聯(lián)（DPC）輻射損傷致DNA鏈間交聯(lián)不如化學損傷多，但也能發(fā)生。但是如所用射線引起的DNA交聯(lián)少而斷裂多，則用此法不太實際。 有實驗研究發(fā)現(xiàn)小牛胸腺脫氧核糖核蛋白（DNP）在uv或γ射線照射以后，其中DNA中不能被提取的部分隨著照射劑量的增加而增加，但用胰蛋白酶處理，則觀察不到這部分DNA。當然DNA鏈被切開后再連接的速度非?？欤试诩尤牒怂醿惹忻傅耐瑫r加入抑制劑或使DNTPs漏出胞核，以阻斷切除修復中DNA合成與再連接，這才可
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