各種疾病的分子基礎(chǔ)-wenkub
2023-04-06 05:03:42 本頁(yè)面
【正文】 結(jié)構(gòu)會(huì)不相同 藉由 structurespecific的內(nèi)切酶 cleavase I來(lái)切，就會(huì)在正常與變異中形成不同的條帶圖形 ( band pattern) Muts 由 E. coli所分泌， Muts蛋白可以跟錯(cuò)配的DNA結(jié)合 與錯(cuò)配的 DNA結(jié)合，造成錯(cuò)配的 DNA 電泳速度減慢 自動(dòng)定序 Automated sequencing 使用 Sanger所發(fā)明的雙去氧鏈終止法的原理 利用 DNA聚合酶，一個(gè)引子、四種 dNTP、四種ddNTP、單股 DNA 模板，類似 PCR方法， DNA聚合酶催化 5‘→3’ 的複製 因 ddNTP沒有 3‘OH，不能與後續(xù)加入的 dNTP的磷酸基團(tuán)，形成磷酸雙脂鍵，所以鏈的延伸就會(huì)終止 調(diào)整每個(gè)定序反應(yīng)中 ddNTP與 dNTP的比例，任何相對(duì)的鹼基都有可能被 ddNTP所取代，只要一取代就形成鏈的終止 定序方法所得到的是大大小單股 DNA 利用 4種螢光分別標(biāo)記 4種不同的 ddNTPs 自動(dòng)定序儀以雷射偵測(cè)器，偵測(cè)時(shí)間和不同螢光顏色， 以電腦加以判讀 ?Fluorescence dideoxy Method I 參考資料： ?Fluorescence dideoxy Method II 一般大量檢體可以先用 PCRRFLP來(lái)做或PCRSSCP分析，有問題的檢 體再送定序 檢體量少或很重要的檢體，可以做完 PCR後就直接定序 所有篩選突變的方法，最終都必須定序來(lái)確定 定序頭尾比較不正確，最好 3‘端及 5’端以另一個(gè)引子做定序 目前技術(shù)大概可一次定 1000 bp 左右 Minisequencing PCR時(shí)，是引子依據(jù)模板逐一加入互補(bǔ)的dNTP做延伸反應(yīng) 此方法則使用 ddNTP。 可以切的就是 Allele 2 多重 PCR (multiplex PCR) 當(dāng) DNA有大段缺損時(shí)，利用位於缺損部位的特殊標(biāo)記，設(shè)計(jì)引子放大這些標(biāo)記 設(shè)計(jì)時(shí)將每個(gè)標(biāo)記的 PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)成大小不同，且可在同一種 PCR狀態(tài)進(jìn)行作用 由結(jié)果產(chǎn)物的大小變化，即可了解缺損的部分及範(fàn)圍 可用於偵測(cè)多個(gè)點(diǎn)突變 設(shè)計(jì)多組 Primer ，做 PCR反應(yīng)，將所有可能突變的位點(diǎn)或基因多個(gè)缺失熱點(diǎn)區(qū)，都擴(kuò)增分析 注意各 primer pairs之間應(yīng)具有相同或相近的擴(kuò)增條件，相互間不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增或 primerdimer的情形 各個(gè)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度要適當(dāng)，必須做 一個(gè)正常的內(nèi)對(duì)照組 ( positive control)以防止擴(kuò)增的假陰性反應(yīng) SSCP單鏈構(gòu)形多形性 single strand conformation polymorphism 單鏈的 DNA在溶液一定的條件下會(huì)形成鏈內(nèi)的局部雙鏈，進(jìn)而形成特定的立體結(jié)構(gòu) 等長(zhǎng)的 DNA片段，如果鹼基組成及序列的不同就會(huì)形成不 一樣的構(gòu)形 特殊的凝膠中電泳，立體構(gòu)形會(huì)影響電泳速度 利用已知樣本跑出來(lái)的條帶圖形與未知樣本比較，就可以找出待測(cè)樣本是否存在突
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1