【正文】 性狀多基因聚合 育種 技術(shù)研究 魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑 魚類分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐與應(yīng)用 課題 6 魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)研究。 2) 精干、務(wù)實(shí)的研究團(tuán)隊(duì)，成效突出： 本項(xiàng)目集中了中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院、中山大學(xué)、浙江大學(xué)、武漢大學(xué)等相關(guān)科研單位和高等院校在本領(lǐng)域的優(yōu)秀人才，具有強(qiáng)烈的使命感和責(zé)任感，經(jīng)過(guò)五年的合作，已取得了相當(dāng)高的學(xué)術(shù)成績(jī)，主要學(xué)術(shù)帶頭人在項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程中發(fā)表了高水平的學(xué)術(shù)論文 ，有的還獲得國(guó)家杰出青年科學(xué)基金資助，已形成一支經(jīng)過(guò)磨練、對(duì)科學(xué)有執(zhí)著追求、精干、務(wù)實(shí)、高效的研究團(tuán)隊(duì)，成為本項(xiàng)目順利實(shí)施的人才保證。 2) 獨(dú)特的研究體系，注重發(fā)揮中國(guó)特色和優(yōu)勢(shì)： 銀鯽多倍體的遺傳背景和同時(shí)具有的雌核發(fā)育生殖和有性生殖雙重生殖方式以及性逆轉(zhuǎn)魚類奇特的性別分化現(xiàn)象為解析魚類生殖和性控的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了 新穎、 獨(dú)特的研究體系，有利于發(fā)揮我國(guó)的特色和優(yōu)勢(shì)。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補(bǔ)（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對(duì)一些重要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、并對(duì)其進(jìn)行泛素化、乙?；土姿峄刃揎椃治?； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動(dòng)子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。通過(guò)這些研究，使我國(guó)在魚類功能基因組研究中居國(guó)際領(lǐng)先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)，為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 采用大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 項(xiàng)目名稱： 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 首席科學(xué)家： 桂建芳 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國(guó)科學(xué)院 湖北省科技廳 一、研究?jī)?nèi)容 基于擬解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這 兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題， 本項(xiàng)目擬集中在魚類主要經(jīng)濟(jì)性狀如生殖、生長(zhǎng)、抗性 的功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)方面， 重點(diǎn)解析這些主要經(jīng)濟(jì)性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開拓關(guān)鍵技術(shù)，其主要研究?jī)?nèi)容包括： 1） 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 及其分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用基因轉(zhuǎn)移、 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降等技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤和免疫熒光定位等方法，重點(diǎn)解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示重要生殖調(diào)控基因在魚類卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換中的功能作用及其調(diào)控機(jī)制；探討魚類配子發(fā)生過(guò)程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及其及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；通過(guò)大規(guī)模 RFLP 分析等呈現(xiàn)技術(shù)，篩選雌雄個(gè)體間性別特異的 DNA 片段標(biāo)記，進(jìn)而通過(guò) Genomic Walking 克隆分離與性別決定和性別分化相關(guān)基因；揭示魚類性別決定和性別 分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 4）魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過(guò)建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們?cè)谌后w和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 解析魚類生殖、 生長(zhǎng)、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 篩選鑒定 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、 可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的功能基因和分子標(biāo)記 30－ 50 個(gè) ； 3. 揭示魚類性別決定與分化、卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制； 4. 闡明魚類生長(zhǎng)激素分泌的信號(hào)通路； 5. 闡明魚類 干擾素系統(tǒng)關(guān)鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機(jī)理；闡明魚類抗寒關(guān)鍵信號(hào)通路及其作用機(jī)理； 6. 建立魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設(shè)計(jì)和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長(zhǎng) 或抗性等目 標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國(guó)際影響的中青年學(xué)術(shù)帶頭人 和學(xué)術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文，其中在有重要國(guó)際影響的期刊（ 相關(guān)領(lǐng)域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，輔以其它分子生物學(xué)方法如目的基因表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導(dǎo)處理等來(lái)分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。 3) 新 穎 的學(xué)術(shù)思路， 起到前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用 ： 本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)了國(guó)際上有關(guān)魚類分子設(shè)計(jì)育種的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題，試圖直接通過(guò)解析魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)闡明其調(diào)控機(jī)理，篩選鑒定可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，由此創(chuàng)建魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，對(duì) 指導(dǎo)并推動(dòng)我國(guó)水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用。 3) 堅(jiān)實(shí)、完善的研究基地，支撐有力： 本項(xiàng)目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、有害生物控制和資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)部門重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室研究基地的研究條件，這些實(shí)驗(yàn)室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí)支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 以下將具體說(shuō)明各課題的主要研究目標(biāo)、主要研究?jī)?nèi)容、承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé) 人及主要學(xué)術(shù)骨干和經(jīng)費(fèi)比例等。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類下丘腦 /垂體的功能基因組以及魚類生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理研究； 腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路和對(duì)魚類生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究； 抑肌素信號(hào)調(diào)控在魚類肌肉細(xì)胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用機(jī)理研究； 可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系研制及其生理學(xué)功能分析； 魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律研究； 生長(zhǎng)調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑研究。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所、中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 陳良標(biāo) 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 沈玉、曹立雪、譚訓(xùn)剛、尤鋒 經(jīng)費(fèi)比例： 10% 課題 5 魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)研究 主要研究目標(biāo)： 建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)；揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系；闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及在群體 和家系中的功能；確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率；創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合育種的技術(shù)路線。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計(jì)劃 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫(kù)構(gòu)建以及與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號(hào)表達(dá)水平改變對(duì)魚體肌肉生長(zhǎng)的調(diào)控研 究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚 QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗(yàn)證； 7. 魚類生長(zhǎng)和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的分子設(shè)計(jì) ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測(cè)序。 7. MAPPING 到圖譜上 300個(gè)標(biāo)記以上；建立后備親魚的核心群體 100尾以上；圖譜定位 QTL1020個(gè)，獲得基因同線性分析的結(jié)果； 8. 獲得可用于魚類轉(zhuǎn) 基因的高效的轉(zhuǎn)座子 和 Cre/lox基因靶位操作體系 ， 獲得 EAF1等基因敲除的斑馬魚胚胎； 9. 獲得轉(zhuǎn)基因魚 P0代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因敲落 的胚胎和 原生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子系統(tǒng) ， 揭示小RNA動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，獲得相關(guān)互作蛋白。 子代親本 2020 尾以上；分析鯉魚 QTL或主效基因的聚合效應(yīng)、育種效率與潛力； 8. 獲得可用于原生殖細(xì)胞操作的、的基因操作載體 ， 獲得具有表型效應(yīng)的基因敲除的純合子個(gè)體； 9. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚 F2 代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞發(fā)育被影響的轉(zhuǎn)基因胚胎 ， 揭示小 RNA 及其互作蛋白和靶基因的相互作用。 項(xiàng)目名稱： 養(yǎng)殖貝類重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析與設(shè)計(jì)育種基礎(chǔ)研究 首席科學(xué)家： 張國(guó)范 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國(guó)科學(xué)院 山東省科技廳 一、研究?jī)?nèi)容 （一）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題 從基因組學(xué)出發(fā)，明確貝類基因組結(jié)構(gòu)與特征，闡明重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，建立貝類分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，是貝類分子育種領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，也是實(shí)現(xiàn)貝類高效 “精確育種 ”的必要前提。 重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析 貝類生長(zhǎng)、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等是貝類 重要或特有的經(jīng)濟(jì)性狀，以功能基因組學(xué)為基礎(chǔ)，篩選上述性狀的關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，闡明基因?qū)π誀畹臎Q定機(jī)制，解析主要性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)。 （二）主要研究?jī)?nèi)容 基于牡蠣全基因組框架圖，比較貝類基因組結(jié)構(gòu)，規(guī)模開發(fā)貝類功能基因和SNP 標(biāo)記；構(gòu)建全基因組序列精細(xì)圖譜和高密度遺傳圖譜。 分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)基礎(chǔ)研究 研究變溫動(dòng)物貝類的基因 表型關(guān)聯(lián)體系對(duì)環(huán)境變動(dòng)的反應(yīng) 效應(yīng)，建立基因型和表型性狀的 GP模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，開發(fā)分子育種計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，開展生長(zhǎng)和抗逆性狀的復(fù)合 /聚合育種， 建立貝類分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)平臺(tái)，進(jìn)行 模擬育種與實(shí)際育種的 驗(yàn)證和相互促進(jìn) 。 構(gòu)建貝類設(shè)計(jì)育種技術(shù)平臺(tái)，突破一些設(shè)計(jì)育種關(guān)鍵技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)育種提供可能。 良種分子設(shè)計(jì)理論和技術(shù)基礎(chǔ)研究 構(gòu)建 23 個(gè)主要育種性狀的 GP 模型； 實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)和抗逆性狀的復(fù)合 /聚合育種，研發(fā)出計(jì)算機(jī)模擬育種技術(shù)， 構(gòu)建育種模擬技術(shù)平臺(tái)并進(jìn)行育種驗(yàn)證，輔助應(yīng)用于新品種的培育。選取產(chǎn)業(yè)影響大，研究基礎(chǔ)好，并已完成全基因組測(cè)序的牡蠣作為代表種類，貫穿六個(gè)課題所有的研究?jī)?nèi)容，同時(shí)選取與牡蠣近源但主要經(jīng)濟(jì)性狀有明顯差異的扇貝和珍珠貝作為研究對(duì)象，聚焦關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題、突出重點(diǎn)，基于組學(xué)等前沿生物學(xué)技術(shù)，深入解析貝類重要經(jīng)濟(jì)性狀形成的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制，探究分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。通過(guò)構(gòu)建高密度遺傳圖譜，對(duì)QTL 進(jìn)行精細(xì)定位，并解析基因 基因、基因 環(huán)境相互作用和基因與 QTL 對(duì)性狀表現(xiàn)的效應(yīng)，為分子育種提供理論和技術(shù)支持。上述技術(shù)途徑如圖 1 所示。 貝類抗病和抗逆的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于牡蠣等全基因組序列信息篩查抗性相關(guān)候選基因；利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組技術(shù)、 RNA 干擾、 DNA 重組技術(shù)等鑒定主效基因，研究基因功能，建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控模型、表達(dá)特征和作用機(jī)理；應(yīng)用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，開展抗性相關(guān)的 QTL 定位，確定牡 蠣等經(jīng)濟(jì)貝類抗性候選功能基因與抗性性