【正文】 1. 提出了新的科學(xué)問題： 本 項目圍繞 RA 自身免疫啟動、異常免疫應(yīng)答、炎癥和組織破壞及干預(yù)策略等發(fā)病和治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行研究，研究方向 具有創(chuàng)新性和突破性研究，對 RA 新的分子機制及相關(guān)分子的探索具有重要意義。 3. 臨床特色： 本項目的實施需要大量臨床標(biāo)本，本項目具有豐富的臨床資源保證了項目的順利進行，國際一流的臨床學(xué)者參與，保證了研究 方向和解決的關(guān)鍵問題切實符合臨床需要，臨床應(yīng)用具有可行性。 2）團隊內(nèi)長期的廣泛合作為項目順利進行奠定堅實的基礎(chǔ)，可使各課題間的密切聯(lián)系得以實現(xiàn)。而炎癥和骨破壞作為上游免疫反應(yīng)導(dǎo)致的直接致病效應(yīng)，在 RA 發(fā)病機制中具有重要作用，是發(fā)病機制上游環(huán)節(jié)致病作用的驗證，也為新 的免疫干預(yù)策略提供最直接的證據(jù)，因此，對 炎癥和骨破壞啟動及進展過程的分子機制 研究十分重要。在綜合本團隊及國外實驗室的最新研究進展基礎(chǔ)上，我們以遺傳因素 作用下， 致病抗原 啟動 異常自身免疫應(yīng)答 ，進而造成關(guān)節(jié) 炎癥及骨破壞這一 RA 發(fā)病的核心途徑為主線 ，對 RA 發(fā)病各環(huán)節(jié)參與致病的關(guān)鍵分子及機制進行系統(tǒng)和全面的研究。 5 12. 研究成果預(yù)期在國內(nèi)外風(fēng)濕病和免疫學(xué)專業(yè)期刊上發(fā)表一系列高水平論文，包括 SCI 收錄文章。 8. 探討一系列小分子參與 RA 自身免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)控的分子機制。 4. 系統(tǒng)分析新發(fā)現(xiàn)的自身抗原特異性 T 細(xì)胞表型和功能特征。 4 二、預(yù)期目標(biāo) 本項目的總體目標(biāo)： 在本項目組已有的前期工作成果和 基礎(chǔ)之上，針對 RA 發(fā)病的不同環(huán)節(jié)，探討 RA 易感基因、自身抗原特征、自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)控機制、炎癥和骨破壞發(fā)生發(fā)展機制，極大推進 RA 致病的免疫學(xué)機制的認(rèn)識，形成新的 RA 免疫致病機制理論；通過早期診斷靶標(biāo)及免疫干預(yù)方法的研究，解決 RA 早期診斷和免疫干預(yù)方法中的關(guān)鍵問題，使我國 RA 的基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療上形成自己的特色，達到國際水平。除了易感基因可做為診斷靶標(biāo)外，本研究團隊前期工作發(fā)現(xiàn)的一系列血清蛋白或抗原，甚至小分子等均可做為新型診斷靶標(biāo)用于 RA 臨床，本項目將對上述新的血清蛋白標(biāo)志分子或抗原進行大樣本研究，為其用于臨床診斷靶標(biāo)提供重要實驗依據(jù)。在前期工作基礎(chǔ)上，本項目利用我們獨有的轉(zhuǎn)基因動物平臺和充足的臨床樣本來源，對不同亞型調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞在 CIA 及 RA 患者發(fā)病過程數(shù)量和功能的異常以及免疫 負(fù)調(diào)控機制、間充質(zhì)干細(xì)胞對 CIA 及 RA 患者 T細(xì)胞活化的抑制作用進行了深入探討。 2. RA的自身免疫應(yīng)答機制研究 ：本 項目組長期從事 RA自身免疫應(yīng)答機制研究，在成熟的免疫學(xué)研究平臺基礎(chǔ)上，對抗原特異性 T細(xì)胞的自身免疫應(yīng)答機制進行深入研究，以項目組前期工作發(fā)現(xiàn)的新抗原為模型，系統(tǒng)探討抗原特異性 T細(xì)胞抗原表位誘導(dǎo)的 T細(xì)胞活化、新發(fā)現(xiàn)的 T細(xì)胞表面分子免疫應(yīng)答調(diào)控機制等原創(chuàng)性研究，為 RA自身免疫應(yīng)答新機制研究提供重要實驗依據(jù)。1 項目名稱： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的免疫學(xué)機制及其干預(yù)策略的研究 首席科學(xué)家： 栗占國 北京大學(xué) 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 教育部 2 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題包括： 從 RA 發(fā)病過程的各環(huán)節(jié)，深入探討 RA 發(fā)病的免疫應(yīng)答及調(diào)控機制，尋找其中關(guān)鍵性分子，為 RA 早期診斷和免疫干預(yù)新策略的研究奠定基礎(chǔ) 。 3. RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機制 ：在前期原創(chuàng)性研究基礎(chǔ)上，從滑膜炎癥的啟動、進展及骨破壞等不同階段，在分子、細(xì)胞及一系列基因敲除動物層面，利用抗體阻斷、 RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染等方法深入研究 Th17與滑膜細(xì) 胞的相互作用，系統(tǒng)闡述 Th17 細(xì)胞調(diào)控滑膜炎癥和骨破壞的分子通路，為發(fā)現(xiàn) RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷的新機制，尋找 RA 新型治療靶點提供依據(jù)。并在前期芯片篩選結(jié)果基礎(chǔ)上，對我們發(fā)現(xiàn)的新的 RA 相關(guān)小分子進行研究，探討其對各種免疫細(xì)胞增殖和分化功能以及膠原性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響。 6. RA 干預(yù)新策略的研究 ： 本項目組成員既往圍繞上述 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進行了大量的原創(chuàng)性研究。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 系統(tǒng)分析前期工作中新發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因、特征性 SNP 和 CNP 基因位點在中國人群 RA 患者中的遺傳易感性，并對其參與致病的免疫遺傳學(xué)機制進行闡述。 5. 闡述抗原表位結(jié)構(gòu)、 T 細(xì)胞表面糖表位及其他表面分子對自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控機制 ，探討 其臨床應(yīng)用價值。 9. 闡明 RA 炎癥啟動、進展和骨破壞過程中免疫細(xì)胞與滑膜細(xì)胞之間的相互作用及其分子機制。 13. 對有臨床應(yīng)用前景的研究結(jié)果申請 相關(guān) 專利。 其中對 RA 易感基因 等 RA 發(fā)病的免疫遺傳學(xué)機制研究對于闡明 RA 的遺傳特性和基因早期診斷及免疫干預(yù)策略研究具有重要意義。在上述 RA 發(fā)病的新的免疫學(xué)機制研究基礎(chǔ)上，我們將從 RA 發(fā)病的不同環(huán)節(jié)，充分把握本團隊的創(chuàng)新性和突破性，對 RA 早期診斷和免疫干預(yù)新策略 進行深入研究。 2. 學(xué)術(shù)隊伍： 1）高水平的學(xué)術(shù)帶頭 人保證了項目研究方向的準(zhǔn)確性和研究方案的可行性。 4. 實驗平臺： 1）所在實驗室既有教育部創(chuàng)新團隊、教育部臨床免疫重點學(xué)科，又有衛(wèi)生部重點實驗室、 211 重點學(xué)科，實驗室裝備先進，技術(shù)力量雄厚，保證了實驗需要的所有技術(shù)平臺，實驗技術(shù)在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平。 12 2. 原創(chuàng)性研究基礎(chǔ)上的新層面的進一步研究： 6 個課題均在團隊大量前期研究基礎(chǔ)上進行，是針對團隊前期發(fā)現(xiàn)的 RA 新易感基因、新抗原和新型調(diào)控分子的作用及致病機制的系統(tǒng)研究，具有很強的原創(chuàng)性，能夠創(chuàng)造一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型臨床診斷和免疫干預(yù)新方法，具有重大的理論和臨床應(yīng)用價值。從 RA 發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)，在RA 發(fā)生的遺傳背景、免疫機制以及臨床診斷和干預(yù)方法等多方面，展開系統(tǒng)的研究工作。 本項目的六個課題均是圍繞 RA 發(fā)病機制中免疫異常、炎癥和組織破壞以及13 干預(yù)策略的關(guān)鍵問題進行設(shè)置，各課題既有明確的研究方向，又有課題間的密切聯(lián)系。課題一至五，共同為課題六提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，而課題六是在其他課題研究的基礎(chǔ)上，研究成果服務(wù)于 RA 治療的必要途徑，為課題一至五提供臨床落腳點。從分子、細(xì)胞、動物模型及患者外周血四個層面系統(tǒng)闡述上述新抗原的致病機制等。 14 4）新的自身抗原在 HLADR4 遺傳背景下誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的實驗研究。 4）新型 RA 中 HLADR4/1 特異性 修飾 抗原的篩選及其抗原表位的鑒定。 經(jīng)費比例： 15% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院北京基因組研究所、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 課題負(fù)責(zé)人： 陳唯軍 學(xué)術(shù)骨干： 楊光、牟峰、張明誠、董潔、孫宏賀、 趙永岐 課題 RA 的自身免疫應(yīng)答機制研究 預(yù)期目標(biāo)： 通過系統(tǒng)研究 RA 患者自身抗原特異性 T 細(xì)胞表位和 T 細(xì)胞表面分子調(diào)控自身免疫應(yīng)答的方式，以及不同 T 細(xì) 胞亞群的調(diào)控機制，深入認(rèn)識 RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的致病機制，最終形成擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的免疫相關(guān)疾病診斷和治療的新產(chǎn)品，提供治療或者控制嚴(yán)重影響我國人民身體健康的自身免疫病的新策略。 3） T細(xì)胞表面糖表位譜系對免疫應(yīng)答功能的影響。 3) 分離純 化 Vγ1 和 Vγ4 γδ T 細(xì)胞，在體外擴增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至關(guān)節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。本課題將從分子、細(xì)胞及一系列基因敲除動物模型水平，利用抗體阻斷、 RNA 干擾和基因轉(zhuǎn)染等不同方法，系統(tǒng)闡述 Th17 等免疫細(xì)胞調(diào)控滑膜炎癥和骨破壞的分子通路。 2） Wnt/DKK1 通路在 RA 滑膜細(xì)胞活化中的作用研究。 2） RA 患者外周血 Treg 細(xì)胞的分布及致病作用研究。 2）上述 RA 相關(guān)小分子調(diào)控免疫功能的機制研究。除了易感基因可做為診斷靶標(biāo)外，本研究團隊前期工作發(fā)現(xiàn)的一系列血清蛋白或抗原，甚至 miRNA 等均可做為新型診斷靶標(biāo)用于 RA 臨床。 2） RA 特征性 SNP 的分布研究。 2）變構(gòu)肽的體外篩選。 3. RA 相關(guān)新型炎癥靶點及其干預(yù)策略研究 1） 針對靶分子的序列特異性 siRNA 的設(shè)計和篩選。 19 3）抗 Cyr61 人源化單克隆抗體的制備及對 RA 骨破壞的抑制作用研究。 4． 分析早期 RA 患者滑膜組織與外周血中自身反應(yīng)性 TCRV 亞家族的表達。 8． 分析 RA 局部炎癥與滑液中炎癥因子對于滑膜細(xì)胞的作用，以及 RA 滑膜細(xì)胞所分泌的炎癥因子對于 RA 中 Th1 和 Th17 細(xì)胞的抗凋亡作用。 12． 從細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞因子分泌等方面，探討 MCSs 對淋巴細(xì)胞的分化的影響。 15． 測定篩選出的變構(gòu)肽對 RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的影響。 19． 構(gòu)建原核表達 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽。 3． 闡明 RA 關(guān)節(jié)滑液中炎癥細(xì)胞亞群及其炎癥因子在 RA 滑膜炎癥的早期作用及相互調(diào)控機制，篩選 RA 炎癥細(xì)胞抗凋亡的調(diào)控機制和新分子。 7． 爭取篩選出新的 RA 關(guān)聯(lián)基因；精確定位多個 RA 關(guān)聯(lián)基因。 11． 研究 OPGHSP 重組蛋白、 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽 。 3． 研究早期 RA 患者的主要 T 淋巴細(xì)胞。 6． 用 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對相應(yīng)的 T 細(xì)胞進行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或Vγ4T 細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的影響。 10． 研究特定亞群 Treg，對 CIA 模型的關(guān)節(jié)炎形成、體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生及組織病理改變的作用。 14． 對篩選出的變構(gòu)肽進行豆蔻酸化修飾、鑒定。 18． 在細(xì)胞水平上，研究 IL17RC 可溶性多肽抑制 RANKL 及炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的生物學(xué)功能。 3． 通過體內(nèi)試驗 初步明確 γδT 細(xì)胞二個主要亞群在 RA 中的作用。 7． 明確 RA 相關(guān) 小 分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的功能。 11． 總結(jié)首批測試結(jié)果，建立初步的 RA 和 HDAC 相關(guān)性假說，并將該假說反饋回 HDACi 分 子的設(shè)計和合成。 15． 闡明 IL17RC 可溶性多肽抑制骨破壞和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的生物學(xué)功能。 3． 深入研究 RAT細(xì)胞免疫生物學(xué)特點。 7． 采用小鼠軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，研究阻斷 Cyr61 后對于成骨細(xì)胞生長與維持的影響。 11． 檢測 MSCs 治療 CIA 模型 IL10/Foxp3 Tg 小鼠血清細(xì)胞因子水平，并分離小鼠脾細(xì)胞，分析各 T 細(xì)胞亞群的數(shù)量、細(xì)胞表型及體外活化功能。 15． 檢測小分子化合物對 CII 免疫后不同階段 CIA 小鼠中 Treg 亞群數(shù)量，格局和功能的改變。 18． 體外實驗研究 OPGHSP 重組蛋白防治骨破壞和抑制炎癥反應(yīng)的作用機制。 2． 系統(tǒng)分析其 TCR 特異性、表達水平以及 ZAP70 等信號途徑改變。 6． 明確 Th17 及其相關(guān)調(diào)控因子如 Cyr61 和 Wnt/DKK 對于 RA 滑膜炎癥和引起 骨質(zhì)破壞的現(xiàn)象。 11． 力爭篩選出多個 RA 關(guān)聯(lián)基因和 CNP，闡明其致病機制。初步評 價針對其得特異性 siRNA 對小鼠 CIA 模型的治療作用。 第四年度 （一）研究內(nèi)容 1. 鑒定與 RA 相關(guān)的新型自身抗原在 RA 發(fā)病過程中的免疫學(xué)特性和功能。 5. 利用已有的 RA 實 驗動物模型，過繼轉(zhuǎn)移針對活化態(tài) T 細(xì)胞的抗體，觀察其治療或者預(yù)防作用。 9. 研究 IL17 與 Cyr61 表達對于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成與功能的作用。分析小分子抑制26 物轉(zhuǎn)染前后 T 細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)靶蛋白的表達水平。 16. 娃兒藤堿類似物 對 CIA 鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用研究 ， 研究小分子化合物在關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療中作用。 20. 人源化 RANKL TNF 樣區(qū)單克隆抗體的制備 。 3. 明確 T 細(xì)胞表位特異性應(yīng)答與疾病相關(guān)性。 7. 明確 RA 炎癥性 滑膜和骨質(zhì)破壞的新分子和調(diào)控的初步途徑。 11. 阻斷自身免疫反應(yīng)的激活治療 RA 的實驗研究 12. 了解變構(gòu)肽治療對 CIA 小鼠模型的免疫系統(tǒng)的影響，了解其發(fā)揮作用的免疫學(xué)機理。 16. 力爭制備出針對 RANKL TNF 樣區(qū)的人源化單克隆抗體。其免疫原性與靶蛋白比較。 6. 通過對上述 RA 相關(guān)小分子功能研究，合成相應(yīng)的模擬物或抑制劑，分別轉(zhuǎn)染膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠動物模型，觀察其對小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)生和炎癥進展的抑制作用。 11. 評價雙靶向 HDACi 分子治療 RA 的效果。 （二）預(yù)期目標(biāo) 1. 通過體內(nèi)和體外實驗篩選理想的負(fù)調(diào)疫苗分子。 6. 了解 RA 相關(guān)炎癥新靶點在 RA 自身免疫發(fā)生中的調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中的動態(tài)生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和數(shù)學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵節(jié)點；并結(jié)合隨機動力學(xué)方程組對白血病細(xì)胞所處不同“平衡態(tài)”做出符合系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的詮釋； 、藥理作用機制詮釋、新型治療藥物發(fā)現(xiàn)和治療方案設(shè)計及臨床轉(zhuǎn)化研究 :利用 APL 細(xì)胞模型、動物模型和臨床樣本闡明 其在有效藥物 (全反式維甲酸和三氧化二砷 )處理過程中生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，運用系