【正文】 集于 100m1干凈 、 滅菌的廣口塑料瓶中 。 2．植物體采集方法 ? 在采集葉面時(shí) ， 一般是用滅菌的剪刀 、 打孔器 、安全刀片等 ， 由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊 ， 并注意不要損傷周圍邊緣 。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來(lái)的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng) 1．土樣采集方法 ? 森林 、 旱地 ， 草地可先掘洞 ， 由土壤下層向上層順序采集； ? 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集 。 三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn) ? 1． 羅列出所要分離的微生物類群； ? 2． 根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù) ， 描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地： ? 3． 將若干樣本分成若干類型 ， 如植物和植物各部 ， 土壤 (類型和土層 )、 巖石 、 水 、 昆蟲和發(fā)酵食品等； ? 4． 羅列出所要考察和測(cè)量的環(huán)境參數(shù) ， 如 pH、鹽分 、 水分 、 氧化還原電勢(shì)及溫度等； 5．列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠； 6．根據(jù)上述 15項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件； 7．用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法； 8．根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法； 9．運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。 ? 因此 ， 建立一更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的 。 據(jù)有的國(guó)家規(guī)定 ，微生物中除啤酒酵母 、 脆壁酵母 、 黑曲霉 、 米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外 ，其他微生物作為食用 ， 均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn) 。在這 — 步 ， 增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用 ， 而且控制得細(xì)一點(diǎn) ， 好一點(diǎn) 。 ? 例如碳源利用的控制 ， 可選定糖 ， 淀粉 、 纖維素 ， 或者石油等 ， 以其中的一種為唯一碳源 ， 那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng) ，而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 從自然界篩選 ? 采樣季節(jié)：以溫度適中 ， 雨量不多的秋初為好 。 這些特性包括形態(tài) 、 培養(yǎng)特征 、 營(yíng)養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、 發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 ? 采樣： 有針對(duì)性地采集樣品 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ，快速 、 準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來(lái) 。 ? 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌 ， 也必須重新進(jìn)行分離純化 。 ? 增殖： 人為地通過(guò)控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì) 。 三、新種分離與篩選的步驟 （ 一）采樣 采樣對(duì)象 以采集土壤為主 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時(shí)間 、 地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多 。 純種分離的方法有劃線分離法 、 稀釋分離法 。 第二節(jié) 培養(yǎng)分離 ? 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟 。 一、成功的分離培養(yǎng)方法 (1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過(guò)程； (2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)； (3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過(guò)程 。 四、自然界中細(xì)菌的分離 (一 )采樣和采集方法 ? 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群 ， 特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí) ， 必須十分重視樣本的采集 。 如果層次要求不嚴(yán)格 ， 可取離地面 5～15cm處的土 。 ? 選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位 、 葉齡 、 葉片正反面和在一片葉上的取樣部位 。 ? 由于表層水中含有泥沙 ， 故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣 。 水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶 。 加入培養(yǎng)基中的天然提取物 ， 部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳 、 氮源 ，如幾丁質(zhì) 、 纖維素或果膠 。 土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離 ? 分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無(wú)需進(jìn)行富集。 ? 土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取 添加及未添加富集底物 (如幾丁質(zhì)、纖維素等 )的土浸出汁平板。 水中細(xì)菌分離的簡(jiǎn)易富集技術(shù) ? 在無(wú)菌的 、 用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng) ， 定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上； ? 在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖 、 多糖及蛋白質(zhì)等 ， 同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖 。 次代培養(yǎng)及純化步驟 涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 如生長(zhǎng)出菌落 ， 則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類 。 五、放線菌的分離 ? (一 )采樣及采集方法 ? 應(yīng)盡可能實(shí)行無(wú)菌操作。 （三）培養(yǎng)基的組成原則 ? 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的 。 ? 分離瓊脂平板制備好后 ， 一般皆應(yīng)在 37℃ 培養(yǎng)箱中存放 3天 。 ? 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過(guò)濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。 ? 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無(wú)菌牙簽挑取 ， 點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng) ， 以進(jìn)一步篩選和分離 。 有時(shí) ， 真菌子實(shí)體形成必須有光線 ， 這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮 。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。 餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集 。 第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針 ? 工業(yè)菌種的育種： 是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造 。 ? (3)改良菌種的評(píng)價(jià) (包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 (2)增加前體物的濃度 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率 ? 提高菌株對(duì)底物的利用率方法： ? a. 通過(guò)確定并改變代謝中的耗能部分 。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種 ， 是迄今為止國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 化學(xué)誘變劑： 化學(xué)因子如堿基類似物 、 5— 氟尿嘧啶 、 烷化劑等 。 而用電離輻射 177。 2． 亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣 ， 造成的遺傳損傷較多 。 電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑 ， 它能造成不可回復(fù)的缺突變 。 3． 每次誘變處理都有一定提高的菌株 ， 往往多次誘變能積累較多的提高 。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 這個(gè)過(guò)程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的 。 初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的 ， 以量為主 。 在以后的復(fù)篩階段 ， 還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離 ， 純化菌株 。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。 將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾 ， 單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi) ， 一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá) 108個(gè)／ ml左右 ， 作為待處理菌懸液 。 4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 亞硝基胍誘變曲霉菌 ? N— 甲基 — N39。 ? (二 )操作步驟 1． 單孢子懸液制備 取斜面 ， 加入 6ml ／ L ， 用接種環(huán)刮下孢子 ， 振蕩試管 ， 立即通過(guò)帶濾紙漏斗過(guò)濾 ， 由此制得單孢子懸液 ， 若孢子液渾濁狀 ， 其孢子濃度可達(dá) l06個(gè)／ ml， 此為待處理孢子懸液 。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大 。 由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感 ， 于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素 ，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死 ， 保存了缺陷型 。 ? 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 ? 1． 將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨 ， 用金屬夾夾住 ， 滅菌 。 ? 5． 二平皿相同方位進(jìn)行比較 ， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于 GM平板上的 。 ? 用接種針或牙簽將 CM上長(zhǎng)出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種 ， 依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種 ，然后一起培養(yǎng) ， 觀察其生長(zhǎng)情況 。 ? 此法缺點(diǎn)是 ， 結(jié)果有時(shí)不明確 ， 而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。 培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出 ， 就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng) 。 第六節(jié) 基因育種 ? 基因重組育種：是運(yùn)用體外 DNA各種操作或修改手法獲得目的基因 ， 再借助于病毒 、 細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體 ， 將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá) ， 或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用 ， 使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另 — 個(gè)細(xì)胞的方法 。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 同一質(zhì)粒在不同條件下 ， 拷貝數(shù)也可能差異很大 ， 有嚴(yán)緊型和松弛型兩種 。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞內(nèi)。 2．取 50ml肉湯中，無(wú)菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振蕩培養(yǎng)。 7．加入 1ml ／ L CaCl2，再加 CaCl2，置冰浴中放置 20min。再插入冰中．加入 37℃ 靜置培養(yǎng) 90min。 常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng) ? 自然系統(tǒng) ? 人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞） （ 1）二價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+，Ca2++輔助噬菌體， Tris+Ca 2+ （ 2）單價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)： PEG+Li+/Cs+/Rb+ （ 3）凍融系統(tǒng) （ 4） Triton處理：人工誘導(dǎo)（ PEG/原生質(zhì)體） 重組 DNA中常用的工具酶 ? 包括限制性核酸內(nèi)切酶 、 DNA連接酶 、DNA聚合酶 、 逆轉(zhuǎn)錄酶等 . 限制性內(nèi)切酶 ? 切開 DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點(diǎn) 。 載體應(yīng)具備以下條件： ? １、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制； ? ２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源 DNA插入； ? ３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽(yáng)性與陰性重組分子； ? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體 DNA與宿主 DNA便于分離； ? ５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。可去除真核生物基因中不表達(dá)的內(nèi)含子。 ? 使 DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長(zhǎng)）反應(yīng)。 一、 DNA連接酶 ? DNA連接酶催化兩條雙鏈 DNA片段相鄰的 5’磷酸和 3’羥基間形成磷酸二酯鍵 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法 。 二、轉(zhuǎn)染和感染 ? 利用噬菌體 DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌 。 重組克隆的篩選與鑒定 ? 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌落 ， 并鑒定重組子的正確性 。 如果重組 DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi) ， 該標(biāo)志基因失活 ， 通過(guò)有無(wú)抗菌素培養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng) ， 還可區(qū)分單純載體或重組載體 （ 含外源基因 ） 的轉(zhuǎn)化菌落 。 ? 三 、 菌落快速裂解鑒定法 ? 從平板上直接挑選菌落裂解后 ， 直接電泳檢測(cè)載體質(zhì)粒大小 ， 判斷有無(wú)插入片段存在 ， 該法適于插入片段較大的重組子初篩 。 ? F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài) (F+細(xì)胞 )；整合狀態(tài) ， 即 F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞 )。 兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配 ， 恢復(fù)為雙倍體