【正文】 30nm。根據(jù)標準生育酚溶液的色譜可以確定所有生育酚的校準因子。 商用油脂的取樣和分析 P07～ P11 使用高效液相層析法（ HPLC）方法測定植物油脂中生育酚和生育三烯酚的含量 定義：該方法描述了使用高效液相層析法（ HPLC）方法測定植物油脂中生育酚和生育三烯酚的含量的步驟。 從歷史上，在 AOCS 方法中，是通過滴定不皂化殘余物來確定可萃取游離脂肪酸的校正值。如果有，用少量的石油醚進行溶解，然后再倒入上述的萃取混合物中。按照步驟 5 描述的那樣，用石油醚重復(fù)對含水相進行萃取，所有的石油醚萃取物在第一個分液漏斗中混合。在空氣中的爆炸極限為 1～ 6％。與水混合時，堿會釋放出大量的熱量，造成容器的破裂。 氫氧化鉀，如同所有堿一樣，可以嚴重的灼傷皮膚、眼睛和呼吸道。 1985～ 1986 年間開展了 Smalley 樣品檢查計劃，下表中的再現(xiàn)性標準偏差數(shù)值（ SR），相對標準偏差百分數(shù)（ RSD％）和再現(xiàn)性參考了該計劃所得出的結(jié)果（參見AOCS List R 489 in Section R of Official Method）。同時應(yīng)該對試劑進行空白校正。 8. 在稱量后，將殘余物溶解在 50mL 的 95％乙醇溶液中，該溶液的溫度為 50℃，滴加有酚酞指示劑，并預(yù)先進行了中和。水浴蒸發(fā)至干燥，過程中緩慢地注入一股清潔、干燥的氮氣。避免吸出石油醚層。 5. 使用相同數(shù)量的石油醚（ 50mL）進行重復(fù)萃取，至少 6 次。 3. 蓋上瓶塞，劇烈搖動至少 1分鐘。 2. 轉(zhuǎn)入萃取筒中，加 95%乙醇至 40mL 刻度處，進行清洗。 的樣品（充分混合），倒入錐形燒瓶，或索氏燒瓶。 4. 氫氧化鈉溶液（ NaOH） — 進行了準確的標定。 商用油脂的取樣和分析 試劑 1. 95％乙醇－ USSD 化學(xué)式 30 和 3A。容量為 200mL（注解 1）。 范圍：應(yīng)用于一般的動物油脂和植物油脂。應(yīng)使用它們的樣品來測定這些生育酚異構(gòu)體在大口徑毛細管柱中的溶解量。將產(chǎn)品轉(zhuǎn)入燒杯中，置于 150℃的電熱板上，進行融化，直到恒重。室溫下結(jié)晶 2個小時（至少）。通風櫥中蒸汽浴 2 小時。生育酚未能完全硅烷化時，所得的結(jié)果偏低。在空氣中的 TLV為 10ppm。吸入即可引起中毒，有麻醉作用。在空氣中的 TLV為 5ppm。該物質(zhì)易燃性很高。計算出的生育酚總含量的變異系數(shù)為177。摻加物的平均回收率為 ％。 (d) 按照要求的條件，向色譜儀中注入 1μ L 試樣（步驟 1）。 (b) 加入 1mL的吡啶，然后再加入 2mL左右的 Sylon BFT。 商用油脂的取樣和分析 (e) 計算相應(yīng)因數(shù)（ FC） FC＝ISdardSdardSIS CA CA ??tantan 式中： ISA ＝十七烷硬脂酸鹽的面積 ,內(nèi)標物 dardSAtan ＝α 生育酚的面積 dardSCtan ＝ α 生育酚的質(zhì)量 mg ISC＝十七烷硬脂酸鹽的質(zhì)量 mg，內(nèi)標物 (f) β 、γ 和δ 生育酚的響應(yīng)因數(shù)同α 生育酚取同一個數(shù)值 FC＝ISdardSdardSIS CA CA ??tantan 式中： ISA ＝十七烷硬脂酸鹽的面積 ,內(nèi)標物 dardSAtan ＝α 生育酚的面積 dardSCtan ＝ α 生育酚的質(zhì)量 mg ISC＝十七烷硬脂酸鹽的質(zhì)量 mg，內(nèi)標物 注 －每天都要重新測量這些因數(shù)。加入 的內(nèi)標溶液（試劑 3）和 15mL 的三氯甲烷。 (h) 衰減為 2 (i) 閥值為 1 (j) 色譜峰區(qū)域?qū)挾葹? 2. α 生育酚相應(yīng)因數(shù)的測定 (a) 準確稱量 20～ 30mg的α 生育酚，倒入容量為 50mL 的錐形燒瓶中。 (d) 分流流率為 150cc/分。 裝置 1. 毛細管氣相色譜儀 — 可以滿足步驟 1 中提到的操作條件 （惠普 5880A，或同類型號儀器），配有一個火焰離子化 檢測器，一個 DB－ 5 毛細管柱（ 30－ m） 2. 電子稱－精度為 ；使用 和 3. 常規(guī)實驗室玻璃器皿 — 包括移液吸管，配有 T 狀磨砂玻璃塞的錐形燒瓶 試劑 （注解，警告） 1. 吡啶 — Mallinckrodt Crom AR 等級（ American Scientific Products 有售），或同類試劑 2. Sylon BFT— Supelco 公司有售，或同類試劑 3. 十七烷硬脂酸鹽，內(nèi)標溶液 — 實驗室按下面的步驟制備：準確稱量適量的十七烷硬脂酸鹽，將其溶解在三氯甲烷里（注解，謹慎），最 終的濃度近似為 。該方法基于甲硅烷基化生育酚可以通過毛細管氣相色譜進行分離。將樣本進行甲硅烷基化處理， Sylon BFT 作為硅烷化試劑，吡啶作為溶劑。見注解 2，制備十七烷硬脂酸鹽溶液 4. α 生育酚 — 參考標準 5. 三氯甲烷 — 試劑等級 步驟 1. 毛細管氣相色譜儀的條件 (a) 毛細管柱， 30－ m DB－ 5， m 薄膜厚度， （注解 3）。 (e) 注入器溫度為 240℃。 (b) 加入 1mL的吡啶， 2mL 的 Sylon BFT。充分混合。一個星期后要制備新的溶液，不用時應(yīng)冷藏。加熱 5～ 10 分鐘，至 50℃，或直到固體完全融解為止。 計算 1. 樣品中的總生育酚含量以α 、β 、γ 和δ 生育酚的總重量百分數(shù)表示： 100% ?? ??? SA CFCAX IS ISX 式中： X% ＝α 、β 、γ 和δ 生育酚的重量百分數(shù) XA ＝α 、β 、γ 和δ 生育酚的面積 FC ＝從步驟 2（ e）中得到的相應(yīng)因數(shù) ISC ＝十七烷硬脂酸鹽的質(zhì)量 mg S ＝樣品質(zhì)量 mg 商用油脂的取樣和分析 2. 總生育酚含量％＝％α 生育酚＋％β 生育酚＋％γ 生育酚＋％δ 生育酚 圖 1 含有膽固醇和內(nèi)標物的除臭器餾出物所特有的毛細管色譜圖 圖 2 含有菜子甾醇的除臭器餾出物的填充塔色譜圖，存在一個內(nèi)標物干擾峰 圖 3 發(fā)生皂化 作用后的除臭器餾出物的填充塔色譜圖，內(nèi)標物干擾峰下方存在一個膽固醇干 擾峰 標定 1. 生育酚溶液的制備和相應(yīng)因數(shù)的計算【步驟 2（ e）】可以滿足標定的需要。β 、γ 和δ 生育酚的準確度無法測定。 ％。 吡啶易燃，容易引起火災(zāi)。與比提純后的吡啶相比，未提純的危險性更大。要避免與皮膚接觸。在通風櫥中使用。樣品未能妥善保藏時，可能會造成生育酚中毒，如此帶來偏低的結(jié)果。 警告 — 反應(yīng)物融解，反應(yīng)進行的過程中，氯化氫釋放大量熱量。使用布氏漏斗分離出結(jié)晶物。制備的 HDS 待用。 參考資料 1. This Method was developed at Distillation Products Division of Eastman Kodak. Rochester. NY. The method was studied collaboratively during 1985 and 1986, and is published in J. Am. Oil. Chem. Soc. 65:1936（ 1988） . 2. Collaborative study results appear in Ibid. 65:881（ 1988） . 表 1 合作研究的統(tǒng)計數(shù)字 a Con mg/g α β γ δ 合計 RSDr α 0 0 0 β 0 0 0 116 γ δ 合計 RSDR α 0 β 116 116 116 γ δ 合計 a 參見參考資料 2 P05～ P06 不皂化物 定義：不皂化物可溶于油脂。但不適用于含有過量不皂化物的油脂，例如，船用照明油。 2. 錐形燒瓶，或索氏燒瓶 — 容量為 100— 200mL。 2. 含水氫氧化鉀（ KOH） — 重量百分數(shù)為 50％。參見 AOCS 的說明書 H12－ 52。加入 30mL的 95%乙醇和 5mL 的 50％ KOH 溶液。全部轉(zhuǎn)入圓筒中，先加入熱的蒸餾水，后加入冷的蒸餾水，直至 80mL 刻度處。澄清，待分層變得清晰。過程中需要劇烈搖動（注解 2）。 連續(xù)使用 10％ 的乙醇溶液清洗，直到吸出溶液在滴加一滴酚酞指示劑（試劑 5）后不再呈現(xiàn)粉色為止。在溶液完全蒸發(fā)后，將殘余物放入一個真空爐中，溫度為 75～ 80℃，內(nèi)部壓力為不高于 200mm水銀柱，繼續(xù)干燥，直到質(zhì)量恒定。使用 的 NaOH 進行滴定，至溶液變紅。 9. 使用不含油脂的不皂化物重復(fù)上述操作，就可以對所有的空白測定進行校正。不皂化數(shù)值參考了 AOCS Official Method Ca 6a40。穿戴厚的橡皮手套和面罩以避免接觸濃堿液。因此應(yīng)妥善保存堿液，以避免上述情況的發(fā)生。在通風良好的通風櫥中使用。 2. 有的情況下，即使進行了 7 次萃取仍不能達到要求。連續(xù)萃取，直至得到萃取物中不再含有皂化物。有跡象表明，由于有些游離脂肪酸可能會轉(zhuǎn)變成為脂肪酸鹽，從而不能被滴定，所以得到的質(zhì)量數(shù)可能會低于實際的質(zhì)量數(shù)。該步驟不能直接適用于加工產(chǎn)物，例如，含有生育酚酯的人造黃油。生育三烯酚與相應(yīng)的生育酚采用同一個校準因子。如果沒有熒光檢測器，可以使用紫外線（ UV）檢測器，其波長設(shè)為 292nm。制備含有的生育酚酯脂肪時需要附加的試劑，對它們的分析參見注解 2 中的試劑部分。 4. 正己烷（見注解，警告）。完成 配制以后，實驗室樣品需要進行避熱、避光保存。注入氮氣，使壓力恢復(fù)到一個大氣壓。（注解 5） (b) β 、γ 和δ 生育酚標準樣品儲備溶液 — 按照 (a)中所描述的方法制備β 、γ 和δ生育酚標準樣品儲備溶液，以及紫外線（ UV）分光儀所需的溶液。 注解－如果使用紫外線（ UV）分光儀，需制備濃度更大的操作溶液。向分析柱中注入大約 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液。注入大約 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液。然后通過水?。囟炔怀^ 40℃）將其小心地融解，以使其 均化，過程中緩慢地攪拌。如果使用熒光檢測器，在層析以前，可能需要進一步稀釋該溶液。向分析柱中注入 20μ L 試液，參照標準樣品（見注解 11）的色譜峰以確定生育酚（和生育三烯酚）的存在。再注入 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液，記下生育酚色譜峰的面積。 4. 兩次測定所得的數(shù)值進行加和平均，得到的數(shù)值可以滿足精度 2中提出的要求。取其中的最小值作為生育酚和生育三烯酚的含量（μ g）。兩次測定的數(shù)值間的差值不應(yīng)大于重復(fù)性數(shù)值（ r），在表 1 中使用直線內(nèi)插法可以減小這個差值。 表 1 生育酚和生育三烯酚的統(tǒng)計分析結(jié)果 生育酚 α β γ δ 豆油 實驗室編號 17 16 17 16 x, μ g/g 69 17 508 263 RSDr，％ 5 5 3 2 RSDR，％ 25 31 7 17 豆油－麥胚芽油（ 1＋ 1） 實驗室編號 15 16 16 14 x, μ g/g 69 217 225 130 RSDr，％ 6 3 5 5 RSDR，％ 19 26 24 20 豆油－玉米油（ 1＋ 1） 實驗室編號 17 17 17 16 x, μ g/g 124 12 603 134 RSDr，％ 6 7 3 3 RSDR，％ 24 19 10 14 人造黃油 實驗室編號 10 — 10 10 x, μ g/g 9 — 17 67 RSDr，％ 19 — 8 3 RSDR，％ 23 — 20 10 生育酚 α β γ δ 精制棕櫚油 實驗室編號 16 — 16 15 商用油脂的取樣和分析 x, μ g/g 203 — 213 45 RSDr，％ 7 — 6 8 RSDR，％ 23 — 14 39 注解 警告 正己烷，易燃，空氣中的 TLV 為 50ppm。 乙醇和甲醇，易燃?？膳c氫氧化鈉＋氯仿、氫氧化鉀＋氯仿，以及高氯酸發(fā)生劇烈反應(yīng)。需要十分謹慎地處理空容器，尤其是那些可能存有蒸氣的容器。需要特別注意皂化的溫度和時間，否則，會降低生育酚在生育酚酯中的回收率。 （ d） 氫氧化鉀溶液－液態(tài)， 60％（ m/m）。加入 100mg 連苯三酚【注解 2，試劑（ c）】，打旋使之溶解。 （ b） 向燒瓶中加入 50mL 的脫離子水，將物質(zhì)定量地轉(zhuǎn)入一個容量為 250mL的分液漏斗中。使用 30mL的二乙醚對含水萃取層再進行 4 次萃取，然后和二乙醚萃取物混合。 （ d） 使用旋轉(zhuǎn)式薄膜蒸發(fā)器，減壓脫除二乙醚，過程中溫度不能大于 40℃。 3. 粒徑為 5μ m 的 LiChrosorb SI 60，或者 Spherisorb S5W 可以作為硅柱填充物。因此，有必要使用紫外線（ UV）分光儀來測