【正文】 List R 489 in Section R of Official Method）。不皂化數(shù)值參考了 AOCS Official Method Ca 6a40。 樣品 分析編號 異常值 不皂化物的平均百分含量％ SR RSD％ R 1 49 2 2 51 3 3 47 0 4 47 2 5 47 2 注解 警告： 醇 （乙醇）易燃。在通風櫥中加熱，或蒸發(fā)該溶液。 氫氧化鉀，如同所有堿一樣，可以嚴重的灼傷皮膚、眼睛和呼吸道。穿戴厚的橡皮手套和面罩以避免接觸濃堿液。使用性能良好的通風裝置，或防毒面具，以保護呼吸道受到堿性粉塵，或蒸氣的傷害。使用強腐蝕性的藥品時，例如氫氧化鉀，通常是向水中加入物質(zhì)的小顆粒，禁止相反的操作。與水混合時，堿會釋放出大量的熱量，造成容器的破裂。因此應妥善保存堿液，以避免上述情況的發(fā)生。 石油醚極度易燃。避免靜電。在空氣中的爆炸極限為 1～ 6％。在通風良好的通風櫥中使用。 編號注解 1. 可以用一個 500mL的分液漏斗代替萃取筒，從而可以不再使用虹吸管。如果使用分液漏斗，將下層的含水萃取層排入到另一個分液漏斗中，石油醚萃取層仍保留在第一個分液漏斗中。按照步驟 5 描述的那樣，用石油醚重復對含水相進行萃取，所有的石油醚萃取物在第一個分液漏斗中混合。 2. 有的情況下，即使進行了 7 次萃取仍不能達到要求。按照步驟 7，再進行一次萃取，然后單獨蒸發(fā)該萃取物，就可以判斷是否達到了要求。萃取物中不能含有不皂化物。如果有，用少量的石油醚進行溶解，然后再倒入上述的萃取混合物中。連續(xù)萃取，直至得到萃取物中不再含有皂化物。 3. 樣品未提純時，通 過滴定得到的萃取游離脂肪酸和其它的可萃取不皂化雜質(zhì)（都被稱為油酸）的校正值會增大。例如，高能脂（用于喂養(yǎng)動物）、原料油、妥爾油、和渣滓油等，與經(jīng)過了提純、漂白和除臭的油相比，它們被認為會有一個較高的游離脂肪酸校正值。 從歷史上，在 AOCS 方法中，是通過滴定不皂化殘余物來確定可萃取游離脂肪酸的校正值。有跡象表明，由于有些游離脂肪酸可能會轉(zhuǎn)變成為脂肪酸鹽，從而不能被滴定，所以得到的質(zhì)量數(shù)可能會低于實際的質(zhì)量數(shù)。通過 GLC 測量不皂化殘余物中游離脂肪酸的總含量，就可以證明這一點。用水重復清洗萃取混合物，直到 洗出液呈中性為止，這樣就可以除去生成的脂肪酸鹽。 商用油脂的取樣和分析 P07～ P11 使用高效液相層析法（ HPLC）方法測定植物油脂中生育酚和生育三烯酚的含量 定義：該方法描述了使用高效液相層析法（ HPLC）方法測定植物油脂中生育酚和生育三烯酚的含量的步驟。該步驟不能直接適用于加工產(chǎn)物，例如，含有生育酚酯的人造黃油。但是，可以測定從這些產(chǎn)物中得到的不皂化物的生育酚含量（注解 2 和參考資料 1）。 范圍：油脂（或從含有生育酚酯的加工產(chǎn)物中獲得的不皂化物）溶于有機溶劑中，直接使用高效液相層析法分離出生育酚個體和生育三烯酚個體 。根據(jù)標準生育酚溶液的色譜可以確定所有生育酚的校準因子。生育三烯酚與相應的生育酚采用同一個校準因子。油脂中的生育酚和生育三烯酚含量通過一定的步驟進行測定，以μ g/g表示。 裝置 注解－所有玻璃器皿應該具有低的光化活度 1. HPLC 裝置－包括一個高壓泵，進樣裝置、檢測器和圖表記錄儀（或記錄積分儀）。使用一個熒光檢測器，激發(fā)波長為 290nm，發(fā)射波長為 330nm。如果沒有熒光檢測器，可以使用紫外線（ UV）檢測器，其波長設(shè)為 292nm。 2. HPLC 分析柱－ 250 4mm，填充物為微小的氧化硅顆粒，平均粒徑大約為 5μ m（注解 3）。 3. 紫外線（ UV）分光儀 — 在設(shè)定波長下，可以進行吸光度的絕對測量。 4. 旋轉(zhuǎn)式薄膜蒸發(fā)器 試劑 注解－所有的溶劑應為 HPLC 級別，或同類級別的其它溶劑。制備含有的生育酚酯脂肪時需要附加的試劑，對它們的分析參見注解 2 中的試劑部分。 1. α 、β 、γ 和δ 生育酚標準樣品（注解 4）。 2. 甲醇（見注解，警告）。 3. 二氯甲醇。 4. 正己烷（見注解，警告）。 5. 異丙醇。 6. HPLC 的流動相 — 正己烷中添加異丙醇（體積比， ： ）。 取樣 1. 配制試樣的實驗室樣品必須按照認可的取樣步驟（例如， ISO5555）制備。完成 配制以后，實驗室樣品需要進行避熱、避光保存。 步驟 1. 生育酚樣品溶液的配制－ (a) α 生育酚標準樣品儲備溶液 — 按下面的方法制備α 生育酚的儲備溶液：準確稱量大約 10mg樣品（試劑 1），倒入容量為 100mL 的量瓶，然后加入正己烷（試劑 4），直至滿刻度。吸取 10mL 的溶液，注入到棕色圓底玻璃燒瓶中。然后使用旋轉(zhuǎn)式薄膜蒸發(fā)器（裝置4）移除全部的正己烷，過程中溫度不能高于 40℃。注入氮氣，使壓力恢復到一個大氣壓。商用油脂的取樣和分析 當所有溶劑都被移去后，馬上將燒瓶從蒸發(fā)器中取出。向燒瓶中注入 10mL的甲醇（試劑 2），打旋，促使生育酚溶解。 在 292nm 波長（入射光）下，測定該溶液的吸光度，然后用 除該數(shù)值即得到濃度（μ g/mL， α 生育酚 ）。（注解 5） (b) β 、γ 和δ 生育酚標準樣品儲備溶液 — 按照 (a)中所描述的方法制備β 、γ 和δ生育酚標準樣品儲備溶液，以及紫外線（ UV）分光儀所需的溶液。按照以下的波長測定各溶液的吸光度，并使用相應的除數(shù)因子（注解 5）計算物質(zhì)的濃度。 296nm β 生育酚＝ 298nm γ 生育酚＝ 298nm δ 生育酚＝ (c) 混合生育酚標準樣品操作溶液 — 取適量的生育酚標準 樣品儲備溶液進行混合，得到混合生育酚標準樣品操作溶液。用正己烷稀釋，得到操作溶液，其中每個生育酚的含量為 1～5μ g/mL。 注解－如果使用紫外線（ UV）分光儀，需制備濃度更大的操作溶液。重要的是，所有的標準樣品都要置于陰暗處，冷藏。 2. 工作參數(shù)的最優(yōu)化 — 如果需要（見注解 7），使分析柱（裝置 2）達到符合要求的情況。在泵的作用下，異丙醇 /正己烷流動相以 1mL/min 的流率在分析柱中至少流動 30 分鐘。向分析柱中注入大約 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液。如果需要，調(diào)整流動相中異丙醇的含量和流率（注解 8）， 以達到以下的狀態(tài)： (a) α 生育酚的保留時間不低于 5 分鐘； (b) 分離器對β 和γ 生育酚的分辨率不低于 。也就是，幾乎接近全部分離（注解 9）。 將檢測器和積分儀的靈敏度，以及記錄紙速調(diào)至最佳。注入大約 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液。不斷注射，直到出現(xiàn)可重復色譜圖。 3. 試樣的制備－在使用液態(tài)實驗室樣品的情況下，應通過均化作用制備試樣，但應避免過濾。如果使用固態(tài)實驗室樣品，將有代表性的部分（也就是，重量含量不低于 10％的實驗室樣品）加入到玻璃燒杯中。然后通過水?。囟炔怀^ 40℃）將其小心地融解，以使其 均化，過程中緩慢地攪拌。實際操作中，試樣的制備應在柔光下進行，無論如何要避免陽光直接照射。 4. 試液的制備－準確稱量大約 2g準備好的試樣（見注解 10），倒入容量為 25mL 的量瓶中。加入一定量的正己烷（試劑 4），打旋，使樣品溶化，然后再加入正己烷，至滿刻度。如果使用熒光檢測器，在層析以前，可能需要進一步稀釋該溶液。重要的是，在進行分析以前，試液應置于陰暗處，并且最好在制備當天就進行分析。 5. 使用 HPLC法測定試液中的生育酚含量－向分析柱中注入 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液，記下生育酚色譜峰的面積。如果沒有積分 儀，就記下色譜峰的高度（ mm）。向分析柱中注入 20μ L 試液，參照標準樣品（見注解 11）的色譜峰以確定生育酚（和生育三烯酚）的存在。記下生育酚色譜峰的面積（或峰高）。如果試液中存在生育三烯酚，并且需確定其數(shù)量，那么要記下其全部色譜峰的面積。應進行重復注射。再注入 20μ L 的混合生育酚標準樣品操作溶液，記下生育酚色譜峰的面積。 6. 測定的數(shù)值－快速演替的進行兩次測定（都包括使用制備好的試液進行重復注射），每次測定都要使用現(xiàn)制的試液。 計算 1. 樣品中α 生育酚的含量按下式計算，單位為μ g/g： mA DaC ? ??? 25 商用油脂的取樣和分析 式中： C ＝α 生育酚標準樣品的濃度（ /mL） A ＝α 生育酚標準樣品的色譜峰面積的平均值 a ＝試樣中的α 生育酚的色譜峰面積的平均值 m ＝采用試樣的質(zhì)量 D ＝稀釋因子 例如，將 25mL 試液稀釋至 1： 10，則稀釋因子取為 10 2. 使用從相應生育酚 標準樣品色譜峰中獲得的數(shù)據(jù)，以同樣的方法計算試樣中的β 、γ和δ 生育酚含量（見注解 12）。 3. 使用相應生育酚的 C 值和 A 值可以估算樣品中的生育三烯酚含量（見注解 13）。 4. 兩次測定所得的數(shù)值進行加和平均，得到的數(shù)值可以滿足精度 2中提出的要求。如果重復性要求沒有被滿足，需要再對試樣進行兩次測定。如果（ xmax－ xmin）＜ r（ r＝重復性數(shù)值，見表 1），那么 4次結(jié)果的平均值就是最終的結(jié)果。另外， 4 次結(jié)果的中位值，即兩個 中間值的平均值，也可以作為最終的結(jié)果。取其中的最小值作為生育酚和生育三烯酚的含量（μ g）。 精度 1. 表 1 中列出了一個國際性的實驗室間研究所得出的統(tǒng)計結(jié)果。 2. 重復性－使用同一套裝置，在同樣的條件下，同一個實驗員對一個試樣進行兩次快速交替的測定。然后將所得的數(shù)值進行平均，得到的數(shù)值不超出表 1 中給出的范圍。兩次測定的數(shù)值間的差值不應大于重復性數(shù)值（ r），在表 1 中使用直線內(nèi)插法可以減小這個差值。 3. 再現(xiàn)性－使用不同裝置，在不同的條件下，兩個不同實驗室的實驗員對一個實驗室樣品進行測定。然后將所得的數(shù)值進行平均，得到的數(shù) 值不超出表 1 中給出的范圍。兩次測定的數(shù)值間的差值不應大于再現(xiàn)性數(shù)值（ R）（見注解 14），在表 1中使用直線內(nèi)插法可以減小這個差值。 表 1 生育酚和生育三烯酚的統(tǒng)計分析結(jié)果 生育酚 α β γ δ 豆油 實驗室編號 17 16 17 16 x, μ g/g 69 17 508 263 RSDr，％ 5 5 3 2 RSDR，％ 25 31 7 17 豆油－麥胚芽油（ 1＋ 1） 實驗室編號 15 16 16 14 x, μ g/g 69 217 225 130 RSDr，％ 6 3 5 5 RSDR，％ 19 26 24 20 豆油－玉米油（ 1＋ 1） 實驗室編號 17 17 17 16 x, μ g/g 124 12 603 134 RSDr，％ 6 7 3 3 RSDR，％ 24 19 10 14 人造黃油 實驗室編號 10 — 10 10 x, μ g/g 9 — 17 67 RSDr，％ 19 — 8 3 RSDR，％ 23 — 20 10 生育酚 α β γ δ 精制棕櫚油 實驗室編號 16 — 16 15 商用油脂的取樣和分析 x, μ g/g 203 — 213 45 RSDr，％ 7 — 6 8 RSDR，％ 23 — 14 39 注解 警告 正己烷，易燃，空氣中的 TLV 為 50ppm。職業(yè)安全與衛(wèi)生條例（ OSHA）建議，在一個時間平均數(shù)中的濃度不應超過 350ng/M3。正己烷蒸氣可以引起肺部不適和神經(jīng)中毒。應在通風良好的通風櫥中使用。 乙醇和甲醇，易燃。在通風良好的情況下進行加熱和蒸發(fā)操作。甲醇有毒性，應避免眼睛接觸，避免吸入蒸氣。在通風良好的情況下使用?？膳c氫氧化鈉＋氯仿、氫氧化鉀＋氯仿，以及高氯酸發(fā)生劇烈反應。 二乙 醚，高度易燃，靠近火源，或火焰時，會發(fā)生劇烈的燃燒和爆炸。吸入和皮膚接觸可以抑止中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動。光直射可以使之形成過氧化物，并引起爆炸。需要十分謹慎地處理空容器，尤其是那些可能存有蒸氣的容器?？諝庵斜O限是 ～ 48％， TLV 是400ppm。應在通風良好的通風櫥中使用。 編號注解 1. 推薦使用含有低溫皂化步驟的方法（參見注解 2）制備不皂化物。需要特別注意皂化的溫度和時間，否則，會降低生育酚在生育酚酯中的回收率。 2. 對含有額外生育酚酯的樣品進行低溫皂化－ 試劑 （ a） 乙醇－近似 96％純（見注解 警告）。 （ b） 乙 醇－絕對 99％純（見注解 警告）。 （ c） 連苯三酚。 （ d） 氫氧化鉀溶液－液態(tài)， 60％（ m/m）。 （ e） 二乙醚－不用事先氧化，含有 ％（ m/m）的連苯三酚（見注解 警告）。 （ f） 鹽酸－ 。 （ g） 硫酸鈉－無水 步驟 （ a） 準確稱量大約 2g準備好的樣品（見取樣部分），倒入容量為 100mL 的平底燒瓶中，使用大約 8mL的乙醇【注解 2，試劑（ a）】，將溶化了的樣品徹底分散，過程中進行緩慢地打旋。加入 100mg 連苯三酚【注解 2，試劑（ c）】，打旋使之溶解。使用氮氣吹掃燒瓶，加入 4m