【正文】 in the next centurythe epidemiology of influenza can be expected to change accordingly. At present,the cells,including MDCK、 Vero、 are remended as cell substance of Influenza Virus Vaccine(Inactivated) production by Vero cell line has been successfully used for Rabies、 IPV、 PIV vaccines production. According to the reports of some literatures and the results from large amounts of test， this dissertation has acplished the major technics of rapidly cultivating Influenza virus in Vero cell and the seed lot system for Influenza Virus Vaccine（ Inactivated， Vero Cell) all， this paper is provide the foundation of further researching Influenza VirusVaccine(Inactivated， Vero Cell). Key word： Influenza virus； Vero cell line； culture。三個(gè)流感類(lèi)型反映了對(duì)人類(lèi)危害程度的順序， 其重要性在于可引起嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率，影響學(xué)校、公共服務(wù)機(jī)構(gòu)和各單位的正常工作。 目前研究應(yīng)用于滅活流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系主要有 MDCK、 VERO、 三個(gè)細(xì)胞系。 第一章 緒論 流感概述 流感是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界范圍流行的呼吸道傳染病 ， 其流行病學(xué)歷史可追蹤到 12 世紀(jì) ,從文獻(xiàn)記載推測(cè) 1510 年可能就有過(guò)世界性大流行，盡管 1580 年已有詳細(xì)的描述，但人們普遍認(rèn)為 18891892 年間的流行病學(xué)資料更可信 并且有回顧性的病原學(xué)證據(jù)為甲型流感病毒 (A/H2N2)。 1981 年我國(guó)郭元吉等發(fā)現(xiàn)豬丙型流感病 毒。 1997 年在香港引起禽流感的人群流行而轟動(dòng)世界， 1999 年末至 2020 年初，歐美及東南亞又爆發(fā)了更大規(guī)模的流感， 2020 年初以來(lái)高致病性禽流感病毒 H5N1 在亞洲的蔓延至今沿末發(fā)現(xiàn)人傳人的傳播途徑。但也存在著一定的局限性：針對(duì)采用雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的流感滅活疫苗存在的上述明顯不足，世界各國(guó)科學(xué)家在選用細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒方面進(jìn)行了大量有益的嘗試，并取得了很 大進(jìn)展。流感病毒 12IgG1 和IgG2a/IgG2b 同型。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以直接利用流感野毒株進(jìn)行生產(chǎn)，能夠?qū)σ荒曛腥魏螘r(shí)間發(fā)生的流行病或大流行均作出快速應(yīng)答，而 不像雞胚生產(chǎn)首先要制備高生長(zhǎng)的重組株（需 4～ 6 周），并能避免污染的雞胚（可能影響生物負(fù)荷和疫苗內(nèi)毒素含量）危險(xiǎn)。 流感的發(fā)病原因與 臨床 癥狀 人類(lèi)一般感染 H H2 或 H3 和 N1 或 N2 亞型病毒。雖然此類(lèi)病毒感染人類(lèi)機(jī)率不高，但病死率很高。乙型流感 病毒只感染人類(lèi)。流感潛伏期為 1～ 5 天，一般為 2 天。全身癥狀通常持續(xù) 3 天 ,偶爾見(jiàn)有高熱長(zhǎng)達(dá) 1 周。原發(fā)性流感肺炎可能是罕見(jiàn)的并發(fā)癥，但病死率高。流感抗體可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年，但在一些高危人群，抗體水平在疫苗接種后數(shù)月內(nèi)可開(kāi)始降低。 HAI 抗體可預(yù)防感染 ,抗 NA 抗體可降低從感染細(xì)胞中釋放的病毒量 ,從而可改善疾病。 流感 疫苗 的種類(lèi) 一類(lèi)為流感病毒滅活疫苗 ， 另一類(lèi)為流感病毒減毒活疫苗，流感病毒滅活疫苗分三代 ，第一代為全病毒疫苗，為經(jīng)甲醛滅活的全病毒顆粒 早期粗制的全病毒疫苗接種后局部和全身反應(yīng)較強(qiáng) ! 60 年代初由于超速離心機(jī)和層析色譜技術(shù)的應(yīng) 用 制成后的全毒疫苗局部和全身反應(yīng)明顯減輕 ，但兒童使用時(shí)仍可出現(xiàn)不良反應(yīng) ，現(xiàn)已少用 ，免疫效果肯定 。對(duì)疫苗沒(méi)有相關(guān)報(bào)道則提示超敏反應(yīng)相當(dāng)罕見(jiàn)。對(duì)全世界文獻(xiàn)檢索顯示 ,疫苗接種 與各種罕見(jiàn)的事件呈弱相關(guān)。許多隊(duì)列研究和病例 對(duì)照研究都顯示，疫苗接種者因肺炎和流感、各種呼吸系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和心力衰竭 的住院率、肺炎和流感的死亡率以及總死亡率均低于對(duì)照。 1941 年美國(guó)首先批準(zhǔn)在人體使用流感疫苗 ； 1943 年在美國(guó)軍隊(duì)中使用，并證實(shí)有效 ； 1945 年雞胚生長(zhǎng)的全病毒流感滅活疫苗首次獲得批準(zhǔn)上市 ； 1947 年流感病毒的抗原漂移可降低流感病毒預(yù)防效果（ H1N1）； 1948 年世界衛(wèi)生組織全球流感檢測(cè)機(jī)構(gòu)，促進(jìn)定期更換流感病 毒疫苗株； 1970 年高生長(zhǎng)的重配株（ Reassortants）：常規(guī)用于疫苗生產(chǎn)； 1970 年開(kāi)發(fā)成功流感病毒裂解滅活疫苗，并投放市場(chǎng)； 1970 年開(kāi)發(fā)流感病毒減毒活疫苗； 1978 年單 擴(kuò)免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（ SRID）用于疫苗接種量的定量試驗(yàn)（ Poteney Test）； 1980 年開(kāi)發(fā)純化的血凝素疫苗（ HA Vaccines）（重組 DNA）； 1980 年疫苗佐劑的應(yīng)用； 1990 年開(kāi)發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒疫苗； 1990 年開(kāi)發(fā) DNA 質(zhì)粒流感疫苗； 2020 年噴鼻型溫度敏感株減毒活疫苗投放市場(chǎng)； 2020開(kāi)發(fā)病毒體（ virosome）亞單位疫苗； 納米流感病毒亞單位疫苗； 加佐劑病毒亞單位疫苗； PER C6 細(xì)胞流感疫苗； VERO 細(xì)胞流感疫苗； MDCK 細(xì)胞流感疫苗； 噴鼻型流感病毒疫苗； 廣 譜免疫原性流感疫苗； 或以上數(shù)種類(lèi)型的搭配。 1995 年 2 月 16 日 WHO 在日內(nèi)瓦召開(kāi)了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物作為生產(chǎn)流感疫苗的基質(zhì)的會(huì)議，討論了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于流感病毒在穩(wěn)定細(xì)胞系中培養(yǎng)的研究結(jié)果，并對(duì)下一步工作提出了建議。 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞增殖應(yīng)答和 Th1 型細(xì)胞因子的釋放明顯高于雞胚培養(yǎng)的疫苗。因此具有效果好、產(chǎn)量高、生產(chǎn)迅速、起始材料易于控制、易于標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)環(huán)境密閉以及保證的穩(wěn)定性和免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)流感疫苗的研究熱點(diǎn)主要是開(kāi)發(fā)不同的佐劑（如MF59,Virosome 等）、不同的免疫途徑、不同的抗原組成及含量的安全性和免疫原性及保護(hù)效果等。作為一個(gè)流感大國(guó)，我國(guó)更應(yīng)加強(qiáng)在在這方面的研究工作，以應(yīng)對(duì)突發(fā)的流感暴發(fā)流行。 1℃培養(yǎng)3 天，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，檢測(cè)其血凝效價(jià)。 細(xì)胞 Vero 細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)表 2。 其他 MEM 培養(yǎng)基 、 小牛血清 、 胰蛋白酶 、 新霉素 、 谷氨酰胺 、 生理鹽水 DHank’s 液 主要儀器 臺(tái)式離心機(jī) (centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置顯微鏡 (olympus) 細(xì)胞操凈臺(tái) (蘇州凈化 ) 二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermoforma) 恒溫培養(yǎng)箱 (上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司 ) 恒溫水浴箱 微量移液器 低溫冰柜 超低溫冰柜 家 用冰箱 刻度吸管 血凝板 加液槽 漩渦振蕩器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 方法 取流感毒種，按一定比例稀釋后接種 Vero 細(xì)胞，置 34℃177。 1℃培養(yǎng) 3 天、 B 型病毒培養(yǎng) 4 天時(shí)流感病毒血凝效價(jià)達(dá)到最高。 其他 MEM 培養(yǎng)基 、 小牛血清 、 胰蛋白酶 、 新霉素 、 谷氨酰胺 、 生理鹽水 、 DHank’s液 主要儀器 臺(tái)式離心機(jī) (centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置顯微鏡 (olympus) 細(xì)胞操凈臺(tái) (蘇州凈化 ) 二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermoforma) 恒溫培養(yǎng)箱 (上海 實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司 ) 恒溫水浴箱 微量移液器 低溫冰柜 超低溫冰柜 家用冰箱 刻度吸管 血凝板 加液槽 漩渦振蕩器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 方法 取流感毒種，按一定比例稀釋后接種 Vero 細(xì)胞，置 30℃、 34℃、 37℃不同溫度培養(yǎng)，三天后收獲培養(yǎng)液，用直接血凝法測(cè)定其血凝效價(jià)，詳見(jiàn)表 4. 表 4 不同溫度培養(yǎng)流感病毒的試驗(yàn)研究結(jié)果 不同（亞）型流感病毒 培養(yǎng)溫度 37℃ 34℃ 30℃ H1N1 1:96 1:128 1:16 H3N2 1:48 1:96 1:8 B 1:32 1:80 1:8 結(jié)果 由表 4 可見(jiàn)， 34℃是流感病毒于 Vero 細(xì)胞內(nèi)繁殖 的最佳溫度。將收獲的病毒液以無(wú)菌方法合并，按不同分裝規(guī)格進(jìn)行分裝。 1℃吸