【正文】 in the next centurythe epidemiology of influenza can be expected to change accordingly. At present,the cells,including MDCK、 Vero、 are remended as cell substance of Influenza Virus Vaccine(Inactivated) production by Vero cell line has been successfully used for Rabies、 IPV、 PIV vaccines production. According to the reports of some literatures and the results from large amounts of test， this dissertation has acplished the major technics of rapidly cultivating Influenza virus in Vero cell and the seed lot system for Influenza Virus Vaccine（ Inactivated， Vero Cell) all， this paper is provide the foundation of further researching Influenza VirusVaccine(Inactivated， Vero Cell). Key word： Influenza virus； Vero cell line； culture。三個流感類型反映了對人類危害程度的順序， 其重要性在于可引起嚴重的發(fā)病率和死亡率，影響學校、公共服務機構和各單位的正常工作。 目前研究應用于滅活流感疫苗生產的細胞系主要有 MDCK、 VERO、 三個細胞系。 第一章 緒論 流感概述 流感是一種嚴重威脅人類健康的世界范圍流行的呼吸道傳染病 ， 其流行病學歷史可追蹤到 12 世紀 ,從文獻記載推測 1510 年可能就有過世界性大流行，盡管 1580 年已有詳細的描述，但人們普遍認為 18891892 年間的流行病學資料更可信 并且有回顧性的病原學證據(jù)為甲型流感病毒 (A/H2N2)。 1981 年我國郭元吉等發(fā)現(xiàn)豬丙型流感病 毒。 1997 年在香港引起禽流感的人群流行而轟動世界， 1999 年末至 2020 年初，歐美及東南亞又爆發(fā)了更大規(guī)模的流感， 2020 年初以來高致病性禽流感病毒 H5N1 在亞洲的蔓延至今沿末發(fā)現(xiàn)人傳人的傳播途徑。但也存在著一定的局限性：針對采用雞胚培養(yǎng)技術生產的流感滅活疫苗存在的上述明顯不足，世界各國科學家在選用細胞培養(yǎng)流感病毒方面進行了大量有益的嘗試，并取得了很 大進展。流感病毒 12IgG1 和IgG2a/IgG2b 同型。細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以直接利用流感野毒株進行生產，能夠對一年中任何時間發(fā)生的流行病或大流行均作出快速應答，而 不像雞胚生產首先要制備高生長的重組株（需 4～ 6 周），并能避免污染的雞胚（可能影響生物負荷和疫苗內毒素含量）危險。 流感的發(fā)病原因與 臨床 癥狀 人類一般感染 H H2 或 H3 和 N1 或 N2 亞型病毒。雖然此類病毒感染人類機率不高，但病死率很高。乙型流感 病毒只感染人類。流感潛伏期為 1～ 5 天，一般為 2 天。全身癥狀通常持續(xù) 3 天 ,偶爾見有高熱長達 1 周。原發(fā)性流感肺炎可能是罕見的并發(fā)癥，但病死率高。流感抗體可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年，但在一些高危人群，抗體水平在疫苗接種后數(shù)月內可開始降低。 HAI 抗體可預防感染 ,抗 NA 抗體可降低從感染細胞中釋放的病毒量 ,從而可改善疾病。 流感 疫苗 的種類 一類為流感病毒滅活疫苗 ， 另一類為流感病毒減毒活疫苗，流感病毒滅活疫苗分三代 ，第一代為全病毒疫苗，為經(jīng)甲醛滅活的全病毒顆粒 早期粗制的全病毒疫苗接種后局部和全身反應較強 ! 60 年代初由于超速離心機和層析色譜技術的應 用 制成后的全毒疫苗局部和全身反應明顯減輕 ，但兒童使用時仍可出現(xiàn)不良反應 ，現(xiàn)已少用 ，免疫效果肯定 。對疫苗沒有相關報道則提示超敏反應相當罕見。對全世界文獻檢索顯示 ,疫苗接種 與各種罕見的事件呈弱相關。許多隊列研究和病例 對照研究都顯示，疫苗接種者因肺炎和流感、各種呼吸系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和心力衰竭 的住院率、肺炎和流感的死亡率以及總死亡率均低于對照。 1941 年美國首先批準在人體使用流感疫苗 ； 1943 年在美國軍隊中使用，并證實有效 ； 1945 年雞胚生長的全病毒流感滅活疫苗首次獲得批準上市 ； 1947 年流感病毒的抗原漂移可降低流感病毒預防效果（ H1N1）； 1948 年世界衛(wèi)生組織全球流感檢測機構，促進定期更換流感病 毒疫苗株； 1970 年高生長的重配株（ Reassortants）：常規(guī)用于疫苗生產； 1970 年開發(fā)成功流感病毒裂解滅活疫苗，并投放市場； 1970 年開發(fā)流感病毒減毒活疫苗； 1978 年單 擴免疫擴散試驗（ SRID）用于疫苗接種量的定量試驗（ Poteney Test）； 1980 年開發(fā)純化的血凝素疫苗（ HA Vaccines）（重組 DNA）； 1980 年疫苗佐劑的應用； 1990 年開發(fā)細胞培養(yǎng)的流感病毒疫苗； 1990 年開發(fā) DNA 質粒流感疫苗； 2020 年噴鼻型溫度敏感株減毒活疫苗投放市場； 2020開發(fā)病毒體（ virosome）亞單位疫苗； 納米流感病毒亞單位疫苗； 加佐劑病毒亞單位疫苗； PER C6 細胞流感疫苗； VERO 細胞流感疫苗； MDCK 細胞流感疫苗； 噴鼻型流感病毒疫苗； 廣 譜免疫原性流感疫苗； 或以上數(shù)種類型的搭配。 1995 年 2 月 16 日 WHO 在日內瓦召開了關于細胞培養(yǎng)物作為生產流感疫苗的基質的會議，討論了幾個實驗室關于流感病毒在穩(wěn)定細胞系中培養(yǎng)的研究結果，并對下一步工作提出了建議。 Vero 細胞培養(yǎng)的流感疫苗誘導的 T 細胞增殖應答和 Th1 型細胞因子的釋放明顯高于雞胚培養(yǎng)的疫苗。因此具有效果好、產量高、生產迅速、起始材料易于控制、易于標準化、生產環(huán)境密閉以及保證的穩(wěn)定性和免疫原性等優(yōu)點。針對流感疫苗的研究熱點主要是開發(fā)不同的佐劑（如MF59,Virosome 等）、不同的免疫途徑、不同的抗原組成及含量的安全性和免疫原性及保護效果等。作為一個流感大國，我國更應加強在在這方面的研究工作，以應對突發(fā)的流感暴發(fā)流行。 1℃培養(yǎng)3 天，收獲細胞培養(yǎng)物，檢測其血凝效價。 細胞 Vero 細胞。結果見表 2。 其他 MEM 培養(yǎng)基 、 小牛血清 、 胰蛋白酶 、 新霉素 、 谷氨酰胺 、 生理鹽水 DHank’s 液 主要儀器 臺式離心機 (centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置顯微鏡 (olympus) 細胞操凈臺 (蘇州凈化 ) 二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermoforma) 恒溫培養(yǎng)箱 (上海實驗儀器廠有限公司 ) 恒溫水浴箱 微量移液器 低溫冰柜 超低溫冰柜 家 用冰箱 刻度吸管 血凝板 加液槽 漩渦振蕩器 細胞培養(yǎng)瓶 方法 取流感毒種，按一定比例稀釋后接種 Vero 細胞，置 34℃177。 1℃培養(yǎng) 3 天、 B 型病毒培養(yǎng) 4 天時流感病毒血凝效價達到最高。 其他 MEM 培養(yǎng)基 、 小牛血清 、 胰蛋白酶 、 新霉素 、 谷氨酰胺 、 生理鹽水 、 DHank’s液 主要儀器 臺式離心機 (centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置顯微鏡 (olympus) 細胞操凈臺 (蘇州凈化 ) 二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermoforma) 恒溫培養(yǎng)箱 (上海 實驗儀器廠有限公司 ) 恒溫水浴箱 微量移液器 低溫冰柜 超低溫冰柜 家用冰箱 刻度吸管 血凝板 加液槽 漩渦振蕩器 細胞培養(yǎng)瓶 方法 取流感毒種，按一定比例稀釋后接種 Vero 細胞，置 30℃、 34℃、 37℃不同溫度培養(yǎng)，三天后收獲培養(yǎng)液，用直接血凝法測定其血凝效價，詳見表 4. 表 4 不同溫度培養(yǎng)流感病毒的試驗研究結果 不同（亞）型流感病毒 培養(yǎng)溫度 37℃ 34℃ 30℃ H1N1 1:96 1:128 1:16 H3N2 1:48 1:96 1:8 B 1:32 1:80 1:8 結果 由表 4 可見， 34℃是流感病毒于 Vero 細胞內繁殖 的最佳溫度。將收獲的病毒液以無菌方法合并，按不同分裝規(guī)格進行分裝。 1℃吸