【正文】 漩渦振蕩器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 方法 取流感毒種，按一定比例稀釋后接種 Vero 細(xì)胞，置 34℃177。 細(xì)胞 Vero 細(xì)胞。作為一個(gè)流感大國，我國更應(yīng)加強(qiáng)在在這方面的研究工作，以應(yīng)對(duì)突發(fā)的流感暴發(fā)流行。因此具有效果好、產(chǎn)量高、生產(chǎn)迅速、起始材料易于控制、易于標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)環(huán)境密閉以及保證的穩(wěn)定性和免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。 1995 年 2 月 16 日 WHO 在日內(nèi)瓦召開了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物作為生產(chǎn)流感疫苗的基質(zhì)的會(huì)議，討論了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于流感病毒在穩(wěn)定細(xì)胞系中培養(yǎng)的研究結(jié)果，并對(duì)下一步工作提出了建議。許多隊(duì)列研究和病例 對(duì)照研究都顯示，疫苗接種者因肺炎和流感、各種呼吸系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和心力衰竭 的住院率、肺炎和流感的死亡率以及總死亡率均低于對(duì)照。對(duì)疫苗沒有相關(guān)報(bào)道則提示超敏反應(yīng)相當(dāng)罕見。 HAI 抗體可預(yù)防感染 ,抗 NA 抗體可降低從感染細(xì)胞中釋放的病毒量 ,從而可改善疾病。原發(fā)性流感肺炎可能是罕見的并發(fā)癥，但病死率高。流感潛伏期為 1～ 5 天，一般為 2 天。雖然此類病毒感染人類機(jī)率不高，但病死率很高。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以直接利用流感野毒株進(jìn)行生產(chǎn)，能夠?qū)σ荒曛腥魏螘r(shí)間發(fā)生的流行病或大流行均作出快速應(yīng)答，而 不像雞胚生產(chǎn)首先要制備高生長的重組株（需 4～ 6 周），并能避免污染的雞胚（可能影響生物負(fù)荷和疫苗內(nèi)毒素含量）危險(xiǎn)。但也存在著一定的局限性：針對(duì)采用雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的流感滅活疫苗存在的上述明顯不足，世界各國科學(xué)家在選用細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒方面進(jìn)行了大量有益的嘗試，并取得了很 大進(jìn)展。 1981 年我國郭元吉等發(fā)現(xiàn)豬丙型流感病 毒。 目前研究應(yīng)用于滅活流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系主要有 MDCK、 VERO、 三個(gè)細(xì)胞系。 關(guān)鍵詞：流行性感冒病毒； Vero 細(xì)胞；繁殖 BSTRACT Influenza caused by influenza virus type A、 B、 C,is important as acause of severe morbidity and mortality that disrupts work in schools， the public services and elsewhere. Duringmajorepidemics many people require medical treatment or mortality often acpanies influenza epidemics， Since they constitute the most rapidly increasing sector of the populations of many countriesprojections show that their numbers are likely to double by early in the next centurythe epidemiology of influenza can be expected to change accordingly. At present,the cells,including MDCK、 Vero、 are remended as cell substance of Influenza Virus Vaccine(Inactivated) production by Vero cell line has been successfully used for Rabies、 IPV、 PIV vaccines production. According to the reports of some literatures and the results from large amounts of test， this dissertation has acplished the major technics of rapidly cultivating Influenza virus in Vero cell and the seed lot system for Influenza Virus Vaccine（ Inactivated， Vero Cell) all， this paper is provide the foundation of further researching Influenza VirusVaccine(Inactivated， Vero Cell). Key word： Influenza virus； Vero cell line； culture。 1993 年在我國病馬中首次分離出馬 2（ H3N8）亞型流感病毒。Kaverin 等發(fā)現(xiàn)，流感病毒在幾種傳代細(xì)胞系中的復(fù)制可因培養(yǎng)液中胰蛋白酶的快速滅活而受到影響； Rocha 等比較了株流感病毒 (H1N H3N2)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的繁殖能力和生長特性后，認(rèn)為流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物和雞胚中的復(fù)制能力具有顯著差異； Webster 等研究發(fā)現(xiàn)，倘若在感染后以適當(dāng)間隔加入胰蛋白酶， Vero細(xì)胞可用于最初 的分離及人甲型和乙型流感病毒復(fù)制。未來幾年 內(nèi)，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚來生產(chǎn)流感疫苗將是大勢所趨，因此，本研究具有一定的理論和實(shí)踐意義。最近，已檢出在 A/H3N2 和 A/H1N1 之間的人 人重配株 ,結(jié)果產(chǎn)生 A/H1N2 亞型。臨床發(fā)病的特點(diǎn)是，突然發(fā)熱、頭痛、不適和肌痛。再次感染后，抗體應(yīng)答更為迅速。此外，單個(gè)核細(xì)胞可浸潤受染氣道，提供抗流感感染細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。綜合征在疫苗接種后 6 周內(nèi)出現(xiàn)，估計(jì)危險(xiǎn)性為 1～2/100 萬，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于流感及其并發(fā)癥的死亡危險(xiǎn)性 ,尤其是流感疫苗接種的目標(biāo)人群。 1937 年 雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功 ，使大量生產(chǎn)疫苗成為可能。 不管是經(jīng) Vero 細(xì)胞還是雞胚培養(yǎng)的疫苗，只有鼻內(nèi)接種活病毒疫苗的小鼠才檢出病毒特異性分泌型 IgA抗體。 . 2 流感疫苗 的研究現(xiàn)狀 目前國內(nèi)外 正在研制的流感疫苗主要有減毒活疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、通用疫苗等類型。 1℃吸附適宜時(shí)間后，補(bǔ)加維持液，置 34℃177。 1℃培養(yǎng) 3 天，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物檢測其血凝效價(jià)。 表 3 不同收獲時(shí)間的流感病毒試驗(yàn)研究結(jié)果 培養(yǎng)時(shí)間 不同 (亞 )型流感病毒 H1N1 H3N2 B 1 1:4 1:2 — 2 1:96 1:64 1:48 3 1:160 1:128 1:64 4 1:160 1:128 1:96 5 1:160 1:128 1:96 6 1:160 1:128 1:96 7 1:128 1:128 1:96 結(jié)果 由表 3 可以看出，甲 1，甲 3 病毒置 34℃177。 其他 MEM 培養(yǎng)基 、 小牛血清 、 胰蛋白酶 、 新霉素 、 谷氨酰胺 、 911 日胚齡雞胚 霍亂濾液 、 生理鹽水 、 DHank’s 液 、 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 、 改良馬丁培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 、 支原菌半流體培養(yǎng)基 主要儀器 臺(tái)式離心機(jī) (centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置顯微鏡 (olympus) 細(xì)胞操凈臺(tái) (蘇州凈化 ) 二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermoforma) 恒溫培養(yǎng)箱 (上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司 ) 恒溫水浴箱 微量移液器 低溫冰柜 超低溫冰柜 家用冰箱 孵化箱 鉆孔器 檢卵器 刻度吸管 血凝板 加液槽 漩渦振蕩器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 注射器 雞胚尿囊腔內(nèi)傳代 原始毒株啟封，以適宜病毒濃度接種 9～ 11 日齡 SPF 雞胚，置 33～ 35℃培育 48～ 72 小時(shí)，剔除死胚，收獲尿囊液。 病毒收獲 當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到 75%左右時(shí)，選擇無污染的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，收獲病毒液。目前唯一可行的流感預(yù)防措施是疫苗接種。 參考文獻(xiàn) [1] 戚鳳春、盛軍流感疫苗的研究進(jìn)展〔 J〕中國生物制品學(xué)雜志， 2020,17（ 3）190192 [2]郭元吉程小雯 .流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù) .北京：中國三峽 出版社， 1997. [3]侯云德舒躍龍李德新 .發(fā)展中國家預(yù)防流感大流行的策略 .中國 疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心， 2020. [4]張華捷編譯張庶民審校 .流感疫苗 .國外醫(yī)學(xué) .預(yù)防、診斷、治 療用生物制品分冊(cè)， 2020,27(4):1451