【正文】 摘 要 流感是由甲 (A)、乙 (B)、丙 (C)三型流感病毒分別引起的一種急性呼吸道傳 染病。三個流感類型反映了對人類危害程度的順序， 其重要性在于可引起嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率，影響學(xué)校、公共服務(wù)機(jī)構(gòu)和各單位的正常工作。 目前研究應(yīng)用于滅活流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系主要有 MDCK、 VERO、 三個細(xì)胞系。其中 Vero 傳代細(xì)胞系解決了外源病毒和致癌性的問題，且易于大規(guī)模培養(yǎng)，被 WHO 推薦作為疫苗生產(chǎn)細(xì)胞 基質(zhì)之一， 使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚來生產(chǎn)流感疫苗將是大勢所趨。 基于上述情況， 通過廣泛的文獻(xiàn)檢索與反復(fù)試驗 ，本文研究了 各 (亞 )型流感病毒于 Vero 細(xì)胞內(nèi)的快速傳代， 流感病毒于細(xì)胞內(nèi)傳代穩(wěn)定性問題，為進(jìn)一步研制 Vero 細(xì)胞 培養(yǎng)流感的病毒 疫苗 提供一定的參考 。 關(guān)鍵詞：流行性感冒病毒； Vero 細(xì)胞；繁殖 BSTRACT Influenza caused by influenza virus type A、 B、 C,is important as acause of severe morbidity and mortality that disrupts work in schools， the public services and elsewhere. Duringmajorepidemics many people require medical treatment or mortality often acpanies influenza epidemics， Since they constitute the most rapidly increasing sector of the populations of many countriesprojections show that their numbers are likely to double by early in the next centurythe epidemiology of influenza can be expected to change accordingly. At present,the cells,including MDCK、 Vero、 are remended as cell substance of Influenza Virus Vaccine(Inactivated) production by Vero cell line has been successfully used for Rabies、 IPV、 PIV vaccines production. According to the reports of some literatures and the results from large amounts of test， this dissertation has acplished the major technics of rapidly cultivating Influenza virus in Vero cell and the seed lot system for Influenza Virus Vaccine（ Inactivated， Vero Cell) all， this paper is provide the foundation of further researching Influenza VirusVaccine(Inactivated， Vero Cell). Key word： Influenza virus； Vero cell line； culture。 第一章 緒論 流感概述 流感是一種嚴(yán)重威脅人類健康的世界范圍流行的呼吸道傳染病 ， 其流行病學(xué)歷史可追蹤到 12 世紀(jì) ,從文獻(xiàn)記載推測 1510 年可能就有過世界性大流行，盡管 1580 年已有詳細(xì)的描述，但人們普遍認(rèn)為 18891892 年間的流行病學(xué)資料更可信 并且有回顧性的病原學(xué)證據(jù)為甲型流感病毒 (A/H2N2)。 特別是 1918 年意大利流感 ,估計全世界死 于流感的人數(shù)達(dá) 40005000 萬 ,有關(guān)資料還顯示人群病死率上升與流感的流行季節(jié)相關(guān) ，在美國每年因流感住院人數(shù)多于 100000 人，死亡近 40000 人， 盡管引起流感流行 ， 特別是大流行的機(jī)制還不十分清楚 ， 但較一致的看法是與流感病毒表面抗原變異和人群普遍缺少免疫力有 關(guān)。 據(jù)了解，1977 年 5 月首發(fā)于我國東北地區(qū)的流感是由 H1N1 亞型流感病毒引起的，一年后波及全球。 H1N1 亞型毒株的重現(xiàn)，造成人流感流行史上罕見的在人群中同時流行著兩個亞型（ H1N1 和 H3N2）毒株的局面。 1981 年我國郭元吉等發(fā)現(xiàn)豬丙型流感病 毒。 1989 年在我國病馬中分離出 8 個基因節(jié)段類似于禽流感病毒的馬 2（ H3N8）亞型流感病毒。 1990 年在我國豬群中首次分離出豬型（ H1N1）流感病毒。 1993 年在我國病馬中首次分離出馬 2（ H3N8）亞型流感病毒。 1997 年在香港引起禽流感的人群流行而轟動世界， 1999 年末至 2020 年初，歐美及東南亞又爆發(fā)了更大規(guī)模的流感， 2020 年初以來高致病性禽流感病毒 H5N1 在亞洲的蔓延至今沿末發(fā)現(xiàn)人傳人的傳播途徑。 2020 年 10 月科學(xué)家復(fù)原了 1918 年流感大流行的病毒基因組序列，證明是禽流感，與當(dāng)前全球流行的 H5N1 病毒有相似性，世界各國正嚴(yán)陣以待，預(yù)防全球 H5N1 流感大流行。 因此流感疫苗的預(yù)防接種仍是當(dāng)今防止流感發(fā)生和流行的最有效的手段之一 。 1937 年雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功 ，使大量生產(chǎn)疫苗成為可能，采用雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感滅活疫苗已經(jīng)有 60 多年歷史，多年的臨床應(yīng)用表明其具有很好的免疫效果和臨床安全性，保護(hù)率一般為 75%～ 90%。但也存在著一定的局限性：針對采用雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的流感滅活疫苗存在的上述明顯不足，世界各國科學(xué)家在選用細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒方面進(jìn)行了大量有益的嘗試，并取得了很 大進(jìn)展。 1995 年 2 月 16 日 WHO 在日內(nèi)瓦召開了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物作為生產(chǎn)流感疫苗 的基質(zhì)的會議，討論了幾個實驗室關(guān)于流感病毒在穩(wěn)定細(xì)胞系中培養(yǎng)的研究結(jié)果，并對下一步工作提出了建議。此后，細(xì)胞流感疫苗的研究取得了飛速發(fā)展。Kaverin 等發(fā)現(xiàn)，流感病毒在幾種傳代細(xì)胞系中的復(fù)制可因培養(yǎng)液中胰蛋白酶的快速滅活而受到影響； Rocha 等比較了株流感病毒 (H1N H3N2)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的繁殖能力和生長特性后，認(rèn)為流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物和雞胚中的復(fù)制能力具有顯著差異； Webster 等研究發(fā)現(xiàn)，倘若在感染后以適當(dāng)間隔加入胰蛋白酶， Vero細(xì)胞可用于最初 的分離及人甲型和乙型流感病毒復(fù)制。流感病毒 12IgG1 和IgG2a/IgG2b 同型。不管是經(jīng) Vero 細(xì)胞還是雞胚培養(yǎng)的疫苗，只有鼻內(nèi)接種活病毒疫苗的小鼠才檢出病毒特異性分泌型 IgA 抗體。 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞增殖應(yīng)答和 Th1 型細(xì)胞因子的釋放明顯高于雞胚培養(yǎng)的疫苗。研究證實 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗與雞胚培養(yǎng)的流感疫苗在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面免疫原性相仿 ,而在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答方面 ,前者優(yōu)于后者。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以直接利用流感野毒株進(jìn)行生產(chǎn)，能夠?qū)σ荒曛腥魏螘r間發(fā)生的流行病或大流行均作出快速應(yīng)答，而 不像雞胚生產(chǎn)首先要制備高生長的重組株（需 4～ 6 周），并能避免污染的雞胚（可能影響生物負(fù)荷和疫苗內(nèi)毒素含量）危險。而且在哺乳動物細(xì)胞中生長的流感病毒比雞胚培養(yǎng)分離的病毒更接近于臨床樣本中的病毒。因此具有效果好、產(chǎn)量高、生產(chǎn)迅速、起始材料易于控制、易于標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)環(huán)境密閉以及保證的穩(wěn)定性和免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。未來幾年 內(nèi)，使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚來生產(chǎn)流感疫苗將是大勢所趨，因此，本研究具有一定的理論和實踐意義。 流感的發(fā)病原因與 臨床 癥狀 人類一般感染 H H2 或 H3 和 N1 或 N2 亞型病毒。微小突變不斷 在這些表面糖蛋白中產(chǎn)生小的變化，引起“抗原性漂移”。另一方面 ,“抗原性轉(zhuǎn)變”包括由不同甲型病毒株的遺傳物質(zhì)重配造成的大的變化，一般認(rèn)為由于動物中甲型流感混合感染引起的。但是，動物亞型的流感病毒偶爾直接引起人類流感。雖然此類病毒感染人類機(jī)率不高，但病死率很高。例如 ,1976 年美國發(fā)現(xiàn)“豬 4 發(fā)。該病毒從家雞和家鴨傳給人，引起 18 例確診病例，其中 6 例死亡。最近，已檢出在 A/H3N2 和 A/H1N1 之間的人 人重配株 ,結(jié)果產(chǎn)生 A/H1N2 亞型。乙型流感 病毒只感染人類。大多發(fā)病較輕、且散在流行，但偶爾也可引起與甲型流感 病毒一樣嚴(yán)重的流行。乙型流感病毒的抗原性變異程度不如甲型流感病毒。流感病毒由呼吸道分泌物傳播給易感人群，主要因子是由感染者打噴嚏、咳嗽或甚至交談產(chǎn)生的小顆粒氣溶膠。流感潛伏期為 1～ 5 天，一般為 2 天。在多數(shù)病例，從發(fā)病前 1～ 2 天到發(fā)病后 4～ 5 天，相當(dāng)于傳染期，在呼吸道標(biāo)本中可發(fā)現(xiàn)病毒。無慢性帶毒狀態(tài)，但在幼兒，病毒排出持續(xù)時間長于成人。臨床發(fā)病的特點(diǎn)是，突然發(fā)熱、頭痛、不適和肌痛。全身癥狀通常持續(xù) 3 天 ,偶爾見有高熱長達(dá) 1 周。咽喉疼痛、鼻炎和無痰性咳嗽在全身癥狀消失后可持續(xù)數(shù)天。無并發(fā)癥患者發(fā)病后 3～ 4 天開始恢 復(fù)，而且恢復(fù)徹底。如有并發(fā)癥，恢復(fù)期就延長，繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎是最常見的流感并發(fā)癥，主要發(fā)生在老年人和某些慢性疾病患者。原發(fā)性流感肺炎可能是罕見的并發(fā)癥，但病死率高。 一般認(rèn)為主要由血清