【正文】 第一篇：申報(bào)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目申請(qǐng)書樣板申報(bào)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目申請(qǐng)書樣板各位申請(qǐng)人：科研處從全國(guó)成功申報(bào)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目中挑選了一份嚴(yán)格按照?qǐng)?bào)告正文撰寫提綱要求撰寫，并在撰寫的整體布局、寫作方法上比較適宜的申請(qǐng)書作為樣板申請(qǐng)書，提供給其他申請(qǐng)人在撰寫申請(qǐng)書時(shí)參考。注：考慮到本項(xiàng)目也將申請(qǐng)國(guó)家自然科學(xué)基金，從技術(shù)保密方面考慮，涉及核心技術(shù)和關(guān)鍵問(wèn)題之處將以“XXXXXXX”代替。報(bào)告正文（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容1立項(xiàng)依據(jù)肝纖維化是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一，迄今沒(méi)有滿意的治療方法。目前國(guó)內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纖維化的關(guān)鍵，抑制HSC的激活對(duì)肝纖維化的防治有重要價(jià)值[1]。粉防己堿（tetrandrine，又名漢防己甲素）是中藥粉防己（Stephania tetrandra S Moore）的主要有效生物堿成分，具有廣泛的藥理作用?？垢卫w維化是Tet的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一。我們研究室在過(guò)去的十幾年中，對(duì)Tet抗肝纖維化作用及機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，證實(shí)Tet是抗肝纖維化有效藥物。然而，由于Tet的劑量安全范圍較小，以往研究發(fā)現(xiàn)的抗肝纖維化有效劑量與中毒劑量比較接近，故成為限制其臨床應(yīng)用的重要因素。近年國(guó)內(nèi)Tet抗肝纖維化研究也由此逐漸走向低谷。為減少毒副反應(yīng)，拓展該藥物的臨床應(yīng)用，我們近四年從降低Tet的單藥劑量、聯(lián)合用藥及改造藥物毒性基團(tuán)等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性探索。新近，我們?cè)趪?guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)，低濃度Tet能上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor factor β，TGFβ）抑制性信號(hào)分子Smad 7表達(dá)，調(diào)控TGFβSmad信號(hào)通路，抑制體外培養(yǎng)靜止期HSC活化，阻斷TGFβ1促靜止期HSC活化效應(yīng)，Tet還誘導(dǎo)活化HSC活化逆轉(zhuǎn)。部分最新研究成果已經(jīng)整理成文發(fā)表在本領(lǐng)域有一定影響力的SCI索引源期刊上，并被SCI收錄(收錄號(hào) IDS Number: 963XN)[2]（相關(guān)文章參詳見(jiàn)申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷及附件二、三）。這些全新研究成果進(jìn)一步增強(qiáng)了我們開(kāi)發(fā)這一傳統(tǒng)中藥的信心。TGFβ1是目前認(rèn)識(shí)的最重要的促肝纖維化因子。抑制TGFβ1對(duì)HSC的作用一直以來(lái)均是抗肝纖維化重要著眼點(diǎn)[3]。Smad 7是HSC TGFβ信號(hào)通路的最主要負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)分子，上調(diào)Smad 7是抑制TGFβ對(duì)HSC不良生物效應(yīng)的有措施之一[4]。在肝纖維化過(guò)程中，TGFβ信號(hào)通路還與整合素信號(hào)通路存在密切聯(lián)系。這表現(xiàn)在三個(gè)方面：①XXXXXX。②XXXXXX。③XXXXXXXXX。綜上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)XXXXX治療?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們研究室在國(guó)家自然科學(xué)基金資助下，過(guò)去三年中應(yīng)用化學(xué)方法合成了RGD和M6P，并將RGD與M6P結(jié)合成一新型復(fù)合分子RGDM6P，研究比較了它們對(duì)HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（項(xiàng)目名稱：RGD修飾細(xì)胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究，編號(hào)：30170412）。我們的研究發(fā)現(xiàn)，RGD和RGDM6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGFβ激活同時(shí)，還可阻止HSC與ECM結(jié)合，阻斷整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究還發(fā)現(xiàn)，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部濃度，使RGDM6P顯示出較RGD更強(qiáng)的抑制作用[14]。我們首次證實(shí)，新型復(fù)合分子RGDM6P用于抗肝纖維化治療，無(wú)論在對(duì)HSC靶向的特異性，還是多位點(diǎn)聯(lián)合作用方面，都優(yōu)于單一的含RGD序列的肽段或M6P（參見(jiàn)基金結(jié)題摘要，相關(guān)文章參見(jiàn)申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷及附件四）。RGDM6P新型復(fù)合分子的研制成功及其對(duì)HSC靶向與抑制功能的發(fā)現(xiàn)，有助于我們?nèi)パ芯扛嗟腍SC靶向選擇性高、局部作用強(qiáng)、系統(tǒng)毒性小的新型藥物和(或)制劑，從而提高藥物的療效、減輕毒性反應(yīng)。結(jié)合我們對(duì)Tet藥理作用的分子機(jī)制的研究結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)，XXXXXXXX?；谝陨舷盗醒芯炕A(chǔ)與設(shè)想，緊跟國(guó)內(nèi)外在制劑學(xué)方面的進(jìn)展，我們擬設(shè)計(jì)XXXXXXXXXXX。當(dāng)前，受體調(diào)節(jié)藥物靶向（receptormediated drug targeting）作為一種新型的給藥系統(tǒng)受到人們的重視[16]。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今為止，尚未見(jiàn)到XXXXXXXXXXX。結(jié)合國(guó)內(nèi)外同行的研究報(bào)道與我們的研究基礎(chǔ)，不難推斷，XXXXXXXXXXXXXXXXX。綜上所述，我們擬在XXXXXXXXXX。本研究將為XXXXXXXX等提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。XXXXXXXXXX可以設(shè)想，如能取得預(yù)期效果，經(jīng)過(guò)良好設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)研究后，這一XXXXXX應(yīng)用于臨床的時(shí)間不會(huì)太久，前景廣闊。參考文獻(xiàn) Friedman of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004。1(2): Chen YW, Li DG, Wu JX, et inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factorbeta in vitro via upregulation of Smad Ethnopharmacol 2005。100(3): Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et strategies for the treatment of chronic liver Clin Exp Res 2005。29(11 Suppl): Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in 2003。125(1): Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et integrin alphavbeta3 is a receptor for the latencyassociated peptides of transforming growth factors beta1 and J 2003。369(Pt 2): Annes JP, Chen Y, Munger JS, et alphaVbeta6mediated activation of latent TGFbeta requires the latent TGFbeta binding Cell Biol 2004。165(5): 、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 ： XXXXX化學(xué)合成與鑒定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成與鑒定。 不同類型脂質(zhì)體的制備、技術(shù)參數(shù)優(yōu)化、物理性質(zhì)鑒定和脂質(zhì)體藥物包封率、載藥量、配體結(jié)合率鑒定與提高。 大鼠HSC分離培養(yǎng)，XXXXXXX 修飾脂質(zhì)體與肝星狀細(xì)胞體外結(jié)合活性研究。 XXXXX 修飾XXXXXXXXX 對(duì)肝星狀細(xì)胞活化、增殖、XXXXXXX信號(hào)通路影響。 究。 XXXXXXXX 對(duì)膽總管結(jié)扎和CCl4大鼠肝纖維化防治作用。XXXXXXXXX 的藥代動(dòng)力學(xué)特征、組織分布特征和XXXXXXX ： 研究構(gòu)建XXXXXXXX，為抗肝纖維化藥物新劑型開(kāi)發(fā)提供新型靶向載體。 研究XXXXXX 對(duì)HSC生物活性影響及機(jī)制，為中西藥結(jié)合肝纖維化雙靶向、多靶點(diǎn)、協(xié)同治療提供理論基礎(chǔ)。 研究XXXXXXXX 體內(nèi)HSC靶向性及防治實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的有效性，為開(kāi)發(fā)中藥新劑型、提高藥物在靶組織濃度、降低有效劑量、減輕副作用和提高療效提供實(shí)踐基礎(chǔ)。 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題： 高藥物包封率、高配體修飾率的穩(wěn)定XXXXXXXX 制備。放射性計(jì)數(shù)法測(cè)定XXXXXX 與HSC結(jié)合活性，有效抑制HSC活化的劑量、時(shí)間參數(shù)等。 XXXXXX 體內(nèi)HSC靶向性、抗肝纖維化效果比較與評(píng)價(jià)。擬采取的研究方案及可行性分析 研究方案：第一部分 XXXXX 及XXXXX 合成(1)XXXXXX 合成及鑒定采用我們研究室建立的方法，化學(xué)合成XXXXXX。應(yīng)用XXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（HPLC）、質(zhì)譜等方法鑒定合成產(chǎn)物純度及分子量。反應(yīng)圖（略）(2)XXXXXXXXXXX 采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（HPLC）和質(zhì)譜分析法進(jìn)物產(chǎn)物純化與鑒定。反應(yīng)圖（略）第二部分 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制備、鑒定與技術(shù)條件優(yōu)化(1)脂質(zhì)體制備采用經(jīng)我們改良的逆相蒸發(fā)法制備。具體方法如下：XXXXXXXXXX。(2)性質(zhì)鑒定XXXXXXXXXXXXXXXX。(3)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化處方根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)，確定影響包封率的主要因素。以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用二項(xiàng)逐步回歸計(jì)算回歸方程，并進(jìn)行方差分析，優(yōu)化條件。第三部分 XXXXX修飾長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體與HSC體外結(jié)合活性 采用兩步膠原酶灌注和密度梯度離心法分離大鼠HSC，選擇靜止態(tài)和激活態(tài)的HSC，接種于6孔板上(105/mL)。待貼壁后，1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞同步化。(1)配體結(jié)合的濃度效應(yīng)關(guān)系XXXXXXXXXXX。(2)配體結(jié)合的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系XXXXXXXXXXXX。(3)競(jìng)爭(zhēng)抑制XXXXXXXXXX。(4)細(xì)胞熒光定位、配體表面結(jié)合率與內(nèi)吞率測(cè)定XXXXXXXXXX。(5)平衡解離常數(shù)(Kd)和細(xì)胞最大結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX對(duì)HSC生物學(xué)特性影響與機(jī)制采用酶法分離大鼠HSC。新鮮分離的HSC，體外培養(yǎng)48 h后，作為靜止期HSC用于下游實(shí)驗(yàn)，或培養(yǎng)1 w后消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，作為活化的HSC用于下游實(shí)驗(yàn)。(1)XXXXXXX對(duì)HSC活化狀態(tài)影響XXXXXXXXX。(2)XXXXXX對(duì)TGFβ1效應(yīng)影響 XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGFβ受體XXXXXXX 信號(hào)通路影響 XXXXXXXXXXXXXX。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1)XXXXXXXX 在肝纖維化大鼠體內(nèi)的器官分布XXXXXXXXXX。(2)XXXXXXX 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)分布 采用XXXXXXXX