實驗四__重組蛋白的sds-page(已修改)
2025-03-02 16:16 本頁面
【正文】 實驗四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 法測定蛋白質(zhì)的分子量 1 實驗?zāi)康? 通過本實驗學(xué)習(xí) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法的基本原理。 初步掌握應(yīng)用此法測定蛋白質(zhì)分子量的操作技術(shù)。 紙電泳 瓊脂糖電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 毛細(xì)管電泳 nativePAGE SDSPAGE IEFPAGE 2DPAGE classification 2 實驗原理 SDS－ PAGE（十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳）， 1967年由 Shapiro等建立 1969年由 Weber和 Osborn進(jìn)一步完善 用于測蛋白質(zhì)亞基分子量 聚丙烯酰胺凝膠聚合原理及有關(guān)特性 聚合反應(yīng) 聚丙烯酰胺是由 單體 (Acr)、 交聯(lián)劑 (Bis)，在 催化劑 (AP或核黃素 ) 和 加速劑 (TEMED)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 ① 丙烯酰胺（ Acr） ： 是凝膠的最主要成分，單體聚合形成長鏈。 ② 甲叉雙丙烯酰胺 (Bis)： 是交聯(lián)劑，將聚丙烯酰胺鏈交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 ③ 過硫酸銨 (AP)或核黃素 (Vb2)：提供自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。 ④ 四甲基乙二胺（ TEMED） ： 是加速劑，它催化過硫酸銨形成自由基。 對核黃素引發(fā)的光聚合也有加速作用。 ?化學(xué)聚合： 使用 AP作催化劑，常用于制備分離膠（小孔膠）。 過量氧會影響鏈的延長和聚合，所以過硫酸銨 (AP)催化的化學(xué)聚合要水封以隔 O2。 ?光聚合 ：使用核黃素作催化劑，聚合反應(yīng)需光照， 適用于制備濃縮膠 (大孔膠 )。 應(yīng)控制 AP和 TEMED的用量，使凝膠在 40min1hr之間聚合完全為宜。 凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T濃度大 ， 孔徑小 ， 移動顆粒穿過網(wǎng)孔阻力大 。 T濃度小 ， 孔徑大 ， 移動顆粒穿過網(wǎng)孔阻力小 。 1 樣品濃縮效應(yīng) (1)凝膠孔徑不連續(xù)性 (2)緩沖體系離子成分及 pH值的不連續(xù)性 (3)電位梯度的不連續(xù)性 (1)凝膠孔徑不連續(xù)性 : 濃縮膠 T=5% 孔徑大 分離膠 T=7%－ 15% 孔徑小 在 2層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。 (2)緩沖體系離子成分及 pH值的不連續(xù)性 : Tris: 緩沖配對離子 ，維持溶液的電中性及 pH值 Cl:在電場中遷移率快，前導(dǎo)離子 (leading ion) ， 快離子 。 Gly:其 pI =， 在 濃縮膠 緩沖體系中，甘氨酸解離度很小，因而在電場中遷移很慢，稱為尾隨離子（ trailing ion） ， 慢離子 。 當(dāng)進(jìn)入 分離膠 時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì) 。因此Cl及 NH2CH2COO沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面 ,然后再分成多個區(qū)帶 . 大多數(shù)蛋白質(zhì)在 ，在電場中，都向正極移動。 (3)電位梯度的不連續(xù)性 V(電泳速度 )=E(電位梯度 ) * m(遷移率 ) E高 m慢 ≈E低 m快 由于蛋白質(zhì)的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此也就聚集在這個移動的界面附近，被濃縮形成一個狹小的中間層。 2 分子篩效應(yīng) 分子量或分子
規(guī)章制度相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1