【正文】 分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用遺傳標(biāo)記（ geic marker）具有多型性易于鑒別與目標(biāo)基因緊密連鎖 ? 性狀標(biāo)記 色澤， 形態(tài) …? 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 倒位，易位， G/N/C帶 …? 生化標(biāo)記 同功酶 …? 分子標(biāo)記 RFLP、 RAPD、 SSR、 AFLP、 SNP… …基礎(chǔ)基礎(chǔ) 基因表達(dá)基因表達(dá)結(jié)果結(jié)果表現(xiàn)型表現(xiàn)型DNA堿基堿基序列變異序列變異形態(tài)標(biāo)記n 遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。n 如穗形、芒長、穗長、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。n 特點(diǎn)：直觀簡(jiǎn)單n 從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時(shí)難以反映基因型差異。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記n 染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等）和帶型（ C帶、 N帶、 G帶等）。n 隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。n 特點(diǎn)：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。 生化標(biāo)記 —— 貯藏蛋白和同工酶n 貯藏蛋白n 同工酶n 特點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低n 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：（ 1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達(dá)與否的限制；（ 2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異； （ 3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個(gè)基因組；（ 4）表現(xiàn)為 “中性 ”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖；（ 5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。分子標(biāo)記的分類（ Staub等 1996）分子標(biāo)記以 Southern為基礎(chǔ)如 RFLP以 PCR為基礎(chǔ)單引物 PCR標(biāo)記 有 RAPD、 APPCR、 DAF、 ISSR等雙引物選擇性擴(kuò)增 PCR 主要指 AFLP需克隆、測(cè)序構(gòu)建特殊雙引物 PCR標(biāo)記如 SSR、 STS等植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記n RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphismn RAPD—RandomAmplifiedPolymorphicDNAs(DAF,APPCR)n SSR—SimpleSequenceRepeatn AFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphismRFLPn 原理： DNA限制性內(nèi)切酶酶切電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小n 酶切： 35ugDNA， 以 10U內(nèi)切酶酶切 5小時(shí) n 電泳： %瓊脂糖膠 70V電泳 16小時(shí) n 染色： EtBr染色 20分鐘 n 變性： HCl20分鐘，抽真空，水冼n 印跡：加入 NaOH， 進(jìn)行 Southern印跡n 沖洗：以 2SSC冼膠，風(fēng)干酶切 — 電泳 — 印跡— 雜交 — 洗脫n 預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、 5HSB、 DenhardtⅢ ） 中， 封好后置 65℃ 溫箱中振蕩 5－ 6小時(shí)。n 雜交：預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好的 marker和探針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置65℃ 溫箱中振蕩過夜。n 洗脫：將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液 65℃ 振蕩洗脫兩次（ 15min/次） ， 吸干包好?！?放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上 ,于暗室中將 X光片放于雜交膜上， 再放上另一張?jiān)龈衅?，裝人暗袋，并用夾板夾好。置 70℃ 超低溫冰箱中曝光 10天左右。使用磷屏儀，操作更方便。RFLP探針探針標(biāo)記 — 隨機(jī)引物法n 25ng變性 DNAn 5ul寡聚核苷酸n 2ulBSAn 3ul[α32P]dCTPn 2ulKlenow酶n 加水至 50ul， 37℃ 溫箱中標(biāo)記 2小時(shí)RFLP標(biāo)記 特點(diǎn)l共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型l穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)l某些植物中開發(fā)探針已遍及整個(gè)基因組l缺點(diǎn)： DNA需要量較大，技術(shù)復(fù)雜； 用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品 ； 在基因組較大、嚴(yán)格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低。RAPDn 原理：n 用一個(gè)隨機(jī)引物（ 810bp）、 堿基隨機(jī)排列的寡核苷酸序列，非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組 DNA， 然后電泳分開擴(kuò)增片段。Polymerase Chain ReactionPCR339。 539。539。 339。Target DNA sequenceGCTCGC AGTACTTCATGACGAGCGdenature 95? C539。 339。339。 539。GCTCGC AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCanneal primers 60? CTaq polymerase binds 3’ and extendsGCTCGC539。 339。339。 539。AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNA is doubled with each cycleRepeat 2540 timesRAPD的操作PCR反應(yīng)：DNA（ 20ng/181。l） 1181。lPrimer 15ng10Buffer Mg2+（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。l） dNTP（ 25mM） 加水至 20181。l， 再加入石臘油，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增Step195℃ 2分鐘Step295℃ 15秒Step336℃ 30秒Step472℃ 45秒Step5GOTOStep246循環(huán)Step672℃ 5分鐘 PCR擴(kuò) 增：主要特點(diǎn)? 無需雜交，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；? DNA需要量少，引物便宜，成本較低；? 技術(shù)簡(jiǎn)便，操作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。? 不同物種間引物通用； v 缺點(diǎn)：大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。DAF(DNA amplification fingerprinting)：與 RAPD不同的是 :引物濃度更高，引物長度更短（一般 5－ 8個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比 RAPDs大得多。 （ CaetanoAnolles等， 1990）APPCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)l引物較長（ 10～ 50bp） ；l引物濃度較高；l引物長度不定，并且常常來自為其它目的而設(shè)計(jì)的引物（如 M13通用測(cè)序引物）。ISSRl 共同優(yōu)點(diǎn)： 在不需要知道所擴(kuò)增 DNA序列情況下，產(chǎn)生 DNA片段的指紋； 需 DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。l 缺點(diǎn)：l 對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差。SCARs（ Sequenced Characterized Amplified Regions）n 為提高 RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo) RAPD片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常 24個(gè)堿基），再進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，可把相應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來。n 具有更高的可重復(fù)性n 共顯性微衛(wèi)星標(biāo)記 (SSR)l真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布 ,大約每隔 1050kb就存在一個(gè) SSR.l哺乳動(dòng)物中約為植物的 56倍 。植物中平均 SSR。雙子葉植物 SSR數(shù)量大于單子葉植物 ,核 DNA SSR數(shù)量多于細(xì)胞質(zhì) DNA。l根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同 ,可分為單堿基、 2堿基、 3堿基、 4堿基等多種重復(fù)型。l