【正文】 保健中心檢驗程序 血清學(xué) 一．血清平板凝集試驗 細菌等顆粒性抗原的懸液與相應(yīng)的抗體結(jié)合后 ,在電解質(zhì)的參與下，抗原顆粒相互凝集形成團塊 ,這種現(xiàn)象叫做凝集反應(yīng)。 操作程序：在潔凈的白瓷反應(yīng)板 (或玻璃板 )上，滴加待檢血清一滴 (約 30ul)，然后加一滴(約 30ul)抗原于血清中，使其充分混合，輕輕搖動平板 2 分鐘，判定結(jié)果。如在 2 分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集塊，背景清亮即可判為陽性；介于二者之間判為可疑。同時，陰陽性對照應(yīng)分別呈陰陽性結(jié)果。 本試驗應(yīng)在 22℃以上的環(huán)境中進行，每次進行反應(yīng)時應(yīng)有陽性血清和抗原對照。 使用前 將抗原和血清從冰箱取出，待其溫度接近室溫時再做試驗。使用前將抗原充分搖勻，每次檢測時作陽性、陰性血清及鹽水對照。并檢測一下抗原是否有自凝現(xiàn)象，如抗原污染細菌或霉菌，出現(xiàn)自凝顆?；蛎箞F時應(yīng)廢棄。如抗原一次使用不完，剩余部分應(yīng)放回冰箱保存。 附：全血平板凝集反應(yīng) 操作方法：在潔凈的白瓷板或玻璃板上，滴上雞白痢 雞傷寒抗原一滴 (約 毫升），立即用針頭刺破雞肱靜脈，用取血環(huán) (內(nèi)徑 毫米金屬絲環(huán) )取 2 滿環(huán)血 (約 毫升 )加入抗原中，充分混勻，輕輕搖動。一般在 20 秒鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)， 2 分鐘判定結(jié)果。 二．免疫擴散試驗 免疫擴散試驗又稱瓊脂凝膠擴散試驗 (AGP)。其原理是抗原抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中可以向四周自由擴散，當(dāng)抗原、抗體擴散至適當(dāng)部位相遇時，則出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線，這是抗原抗體的特異性結(jié)合物，可以用此試驗測定未知的抗體或抗原。 免疫擴散試驗可診：雞傳染性法氏囊病，雞傳染性支氣管炎，雞馬立克氏病，禽腦脊髓炎，雞病毒性關(guān)節(jié)炎，禽流感，雞痘，禽霍亂，雞傳染性鼻炎，禽白血病，雞傳染性喉氣管炎。在免疫擴散試驗中，雖然瓊脂平板的制備隨診斷疾病而異 ,但其操作方法基本相同。大體有三種，即： PBS， %PBS， BBS。瓊脂平板由供應(yīng)室制備。 在試驗前，將抗原及陽性血清按稀釋的要求配制。從冰箱取出備用的瓊脂板，用外徑為4 毫米的打孔器按六角形圖案打孔，中心孔與周圍孔的孔距為 3 毫米。將孔中的瓊脂用 68號針頭輕輕向上挑出即可。在酒精燈上稍加熱，蒸發(fā)其表面水分，即封底，目的是防止瓊脂 與平皿底脫離。然后作好標(biāo)記，準備加樣品。中心孔滴加抗原， 4 孔加入陽性血清。 6 孔各加入待檢血清（抗原和待檢血清各孔加約 30 微升，每加一份血清更換一個滴頭。）加至孔滿為止，但不要溢出。待孔中液體吸干后，將平皿倒置，放入 37℃溫箱中，保持一定的濕度，經(jīng) 2448 小時后，在 8 瓦日光燈下觀察結(jié)果。 判定： 1．陽性：標(biāo)準陽性血清與抗原之間有明顯致密的沉淀線時，受檢也形成沉淀線或者陽性血清的沉淀線末端向毗鄰的受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎者，此判為陽性。 2．陰性：受檢血清與抗原之間不形成沉淀線或者陽性血清的向毗鄰受檢孔直伸或其向外側(cè)偏彎者，此受檢血清判為陰性。 三．紅細胞凝集試驗（ HA） 和紅細胞凝集抑制試驗（ HI）的操作程序 （一） 雞新城疫（ ND）的 HA 和 HI 試驗 1．試驗準備 11．抗原：從中監(jiān)所或 哈獸研買的已知抗原。 12． 1%紅細胞懸液的配制 由雞翅靜脈或心臟采血，放入紅細胞保存液內(nèi)（保存液 2 份，血液 1 份），混勻。將此血液注入離心管中，經(jīng) 20xx 轉(zhuǎn) /分鐘，離心 5 分鐘，用吸管吸去上清夜和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加 % 生理鹽水洗滌；再經(jīng) 20xx 轉(zhuǎn) /分鐘，離心 5 分鐘，棄去上清夜，加 % 生理鹽水洗滌。如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細胞泥，按 1% 的稀釋度加入生理鹽水（ 1 毫升紅細胞泥加 99 毫升 % 的生理鹽水）。 13． 被檢血清：由雞場送來的裝有全血的采血管，經(jīng) 10000 轉(zhuǎn) /分鐘，離心 5 分鐘，待血清析出后使用。 14． %生理鹽水：由供應(yīng)室提供。 15．紅細胞保存液：由供應(yīng)室提供。 2．紅細胞凝集試驗（ HA） HA 試驗主要是測定病毒的紅細胞凝集價，以確定紅細胞凝集抑制試驗所用的病毒稀釋 倍數(shù)（抗原單位）。本試驗采用 96 孔 V型微孔塑料板，可同時測 8 個樣品。 21． 用 12 頭移液器向每個孔中加入 %生理鹽水 毫升。 21．用單頭移液器吸取 毫升待測病毒抗原液加入第一孔中，進行反復(fù)稀釋（此時應(yīng)注意不要產(chǎn)生氣泡），一般擠壓 5 次即可，使病毒液與生理鹽水充分混勻，再 吸出 毫升加入第二孔中，如此連續(xù)稀釋至第 11 孔，病毒稀釋倍數(shù)依次為 1:21:2048，最后從第 11孔中取出 毫升棄去。第 12 孔做紅細胞對照孔。每次至少重復(fù)測 4 排病毒液，以消除偶然誤差。 22． 用 12 頭移液器每孔各加入 1%紅細胞懸液 毫升。 23．在微型震蕩器上震蕩，混勻約 12 分鐘，再靜置。在 1822℃室溫下作用 40 分鐘后觀察結(jié)果。如下圖： 孔號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒 稀釋倍數(shù) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 紅細胞對照孔 稀釋液 （ m） 病毒液 （ ml） 棄去 1%紅細胞 （ ml） 判定 （例） ? ? ? ? ? ? ? ? ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ 注： ++++表示完全凝集， ++表示不完全凝集， 表示不凝集。 3 每次測定樣品都應(yīng)做紅細胞對照。 結(jié)果觀察：將反應(yīng)板豎立于桌上，沉于管底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線形流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明 紅細胞已被病毒所凝集。如上例，病毒液 HA 效價為 1:256，在 HI試驗時，病毒抗原液 ml 內(nèi)須含 4 個凝集單位，則應(yīng)將病毒液 作成 256/4=64 倍的稀釋液。 4．紅細胞凝集抑制試驗（ HI） 新城疫病毒凝集紅細胞的作用，能被特異性抗體抑制。因此，可用 HI 試驗測定雞血清中的 HI 抗體效價（滴度）。本試驗同樣采用 96 孔 V型塑料板。 41． 用 12 頭移液器向每個孔加入生理鹽水 毫升。 42． 用單頭移液器吸取待檢血清 毫升加入第一孔中，反復(fù)擠壓 5 次，使稀釋液與血清混勻，再吸出 毫升加入第二孔中，如此連續(xù)稀釋 至第 12 孔，最后棄去 毫升。 43． 用 12 頭移液器吸取上述 HA 試驗中 4 單位病毒液，于每孔中各加入 毫升。 44． 置于震蕩器上混勻 12 分鐘，再在 1822℃室溫下靜置 20 分鐘。 45． 用 12 頭移液器吸取 1%紅細胞懸浮液，各孔加入中 毫升。 46． 置于震蕩器上震蕩混勻 12 分鐘，在 1822℃室溫下作用 40 分鐘后觀察結(jié)果。如下圖： 孔號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 被檢血清 稀釋倍數(shù) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 紅細胞對照孔 稀釋液 （ ml） 被檢血清 （ ml） 棄去 病毒液 (ml) （ 4單位） 1%紅細胞 （ ml） 判定 （例） ? ? ? ++ ++++ ++++ ++++ 注： ++++表示完全凝集， ++表示不完全凝集， 表示不凝集。 47． 結(jié)果判定：將反應(yīng)板豎立于桌上，沉于管底的紅細胞沿著斜面向下呈線狀流動者，表示血清中含有足量能抑制病毒液凝集 紅細胞的抗體；若孔底的紅細胞呈現(xiàn)邊緣不齊的分散狀態(tài)，表示血清中的抗體量不足以完全抑制病毒凝集紅細胞的作用，或者表示血清中無特異性抗體。 能將 4 單位病毒物質(zhì)凝集紅細胞的作用完全抑制的血清最高稀釋度倍數(shù)，稱為該血清的紅細胞凝集抑制效價，用以 2 為底數(shù)的對數(shù)（ Log2）表示。上表 HI 效價為 8（ Log2）。 （二） .雞減蛋綜合癥（ EDS76）的 HA 和 HI 試驗 雞減蛋綜合癥（ EDS76）的 HA 和 HI 試驗的操作步驟同于雞新城疫的 HA 和 HI 試驗，只是雞減蛋綜合癥的 HI 試驗中加入 1%紅細胞懸 浮液，震蕩混勻后，在 1822℃下作用 30分鐘后觀察結(jié)果。 （三） 雞毒支原體（ MG）的 HA 和 HI 試驗 1．紅細胞凝集試驗（ HA） 操作步驟同于 ND 的（ HA）試驗，用量也相同。 2．紅細胞凝集抑制試驗（ HI） 21．用移液器向第 1 孔中加生理鹽水 ，第 2 孔至第 12 孔每孔加生理鹽水 。 22．用單頭移液器吸取待檢血清 加入第 1 孔中，反復(fù)擠壓稀釋 5 次，吸出 加入第 2 孔中，如此連續(xù)稀釋至第六孔，血清稀釋倍數(shù)依次為 1:101:320，最后從第六孔中吸出 棄去。 23． 用 12 頭移液器向各孔加 HA 試驗中的 4 單位病毒液 。 24．置于震蕩器上震蕩混勻 12 分鐘，在室溫 1822℃靜置 20 分鐘。 25．用 12 頭移液器吸取 1%紅細胞懸浮液 加入各孔中。 26．置于震蕩器上震蕩混勻 12 分鐘，在室溫 1822℃靜置 40 分鐘后觀察結(jié)果。 27．結(jié)果判定：血清 HI 抗體效價 ? 80 的為陽性。 （四） 滑液囊支原體（ MS）的 HA 和 HI 試驗 操作步驟及用量和判定結(jié)果全同于雞毒支原體的 HA 和 HI 試驗。 （五） 傳染性支氣管炎（ IB）的 HA 和 HI 試驗 操作步驟及用量同于雞新城疫的 HA 和 HI 試驗，只是在試驗中所用的紅細胞懸液的濃度為 %。 （六） 檢測血清的禽淋巴白血病 ELISA實驗程序 準備：所有試劑在使用之前都應(yīng)回復(fù)到室溫。并且應(yīng)輕旋混勻。 1．取出已包被好抗體的酶標(biāo)板，作好標(biāo)記，并在 FlockCheck 工作表上作好加樣記錄。 2．在 A1， A2 孔中各加入 100ul 陰性對照樣品。 3．在 A3， A4 孔中各加入 100ul 陽性對照樣品。 4．將每份待檢血清樣品 100ul 加入相應(yīng)孔中。樣品可作適量的重復(fù)。 5．在室溫下孵育 60 分鐘。 6．將所有孔中的液體甩入一個廢液回收容器 內(nèi)。 7．用約 300ul 的蒸餾水或去離子水洗滌每孔 35遍。每次洗滌都應(yīng)將水甩凈。 8．在每孔中加入 100ul兔抗 p27辣根過氧化物酶結(jié)合物。 9．在室溫下孵育 60 分鐘。 10．重復(fù)第 6， 7兩步。 11．在每孔中加入 100ul TMB底物溶液。 12．在室溫下孵育顯色 15 分鐘。 13．在每孔中加入 100ul終止液終止反應(yīng)。 14．用空氣將酶聯(lián)儀調(diào)零。 15．在 650nm波長下測量并記錄標(biāo)準對照孔和樣品孔的光吸收值。 16．計算結(jié)果。 （七） 檢測蛋清的禽淋巴白血病 ELISA實驗程序 濃的蛋白樣品有時很難靠標(biāo)準 的水洗過程洗凈。試劑盒提供了一種 20 倍濃度的洗液用于蛋白樣品的洗滌。濃洗液應(yīng)在實驗前回復(fù)到室溫，并且應(yīng)確保混勻了任何未溶解的沉淀。使用時將濃洗液 1:20稀釋，如： 20ml 濃洗液加入 380ml水中，可用于一塊酶標(biāo)板的洗滌。另外，所有試劑在使用之前都應(yīng)回復(fù)到室溫，并且應(yīng)輕旋混勻。 1．標(biāo)準樣品及待檢樣品的處理，與前面檢測血清的禽淋巴白血病 ELISA實驗程序的 15步相同。 2．在室溫下孵育樣品 60 分鐘后